Ольга Ильинская

¹ Кафедра микробиологии, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань 420008, Россия

Вера Ульянова

¹ Кафедра микробиологии, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань 420008, Россия

Ирина Лисевич

¹ Кафедра микробиологии, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань 420008, Россия

Елена Дудкина

¹ Кафедра микробиологии, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань 420008, Россия

Наталия Захарченко

² Казанский институт биохимии и биофизики ФНЦ Казанский научный центр РАН, г. Казань 420008, Россия

Александра Кусова

² Казанский институт биохимии и биофизики ФНЦ Казанский научный центр РАН, г. Казань 420008, Россия

Джигангир Файзуллин

² Казанский институт биохимии и биофизики ФНЦ Казанский научный центр РАН, Казань 420008, Россия

Юрий Зуев

² Казанский институт биохимии и биофизики ФНЦ Казанский научный центр РАН, г. Казань 420008, Россия

³ Казанский государственный энергетический университет, г. Казань 420066, Россия

¹ Кафедра микробиологии, Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань 420008, Россия

² Казанский институт биохимии и биофизики ФНЦ Казанский научный центр РАН, г. Казань 420008, Россия

³ Казанский государственный энергетический университет, Казань 420066, Россия

Академический редактор: Антонелло Мерлино

Поступило 18 июля 2018 г .; Принято 18 сентября 2018 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Abstract

При подтверждении кристаллографических исследований секретируемая рибонуклеаза Bacillus pumilus (биназа) долгое время считалась мономерной по форме.Недавние данные, полученные с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и эксклюзионной хроматографии, позволяют предположить, что биназа на самом деле является димерной. Чтобы устранить двусмысленность и противоречия в данных, мы измерили конформационные изменения, гипохромный эффект и гидродинамический радиус биназы. Была зарегистрирована неизменность вторичной структуры биназы при переходе от низкой к высокой концентрации белка, что свидетельствует о димеризации биназы сразу после транслокации через клеточную мембрану и приводит к обнаружению димеров биназы только в культуральной жидкости независимо от концентрации рибонуклеазы.Наши результаты заставили по-новому взглянуть на стабильность и цитотоксичность биназы по отношению к инфицированным вирусом или опухолевым клеткам.

1. Введение

Низкомолекулярная гуанилпредпочтительная рибонуклеаза (РНКаза), секретируемая Bacillus pumilus , известна своей биологической активностью, включая противовирусное и противоопухолевое действие [1–5]. Биназа, банальное название фермента, происходит от первых букв названия его штамма-продуцента, Bacillus intermediateus , который недавно был повторно идентифицирован как B.pumilus молекулярными методами [6]. Начиная с первых публикаций [7] биназа рассматривалась как мономерный катионный белок с молекулярной массой 12 кДа. Сегодня димеризация биназы подтверждена прямым наблюдением димеров в культуральной жидкости продуцента [8], что подтверждает теоретические расчеты ассоциации мономера биназы в растворе [9]. Ковалентные связи не участвуют в олигомеризации биназы из-за отсутствия в молекуле остатков цистеина, содержащих SH-группы.Вероятно, димеризация происходит при взаимодействии N- или C-концевых доменов (замена домена), что свидетельствует о наличии нескольких моделей димеров, различающихся по стабильности [8].

Секреция белка в Bacillus в основном опосредуется системой Sec. Шаперон SecB направляет вновь синтезированный секретируемый белок в поры мембраны SecYEG, предотвращая его сворачивание в нативную структуру [10]. Сигнальная последовательность биназы из 28 аминокислотных остатков типична для белков с транслокацией Sec, за которой следует отрицательно заряженный пропептид из 24 аминокислотных остатков.Такие небольшие пропептиды увеличивают эффективность секреции белка у Bacillus [11]. Белки, перемещенные через поры SecYEG на поверхность клетки, сразу же приобретают нативную конформацию, чтобы избежать протеолитической деградации. Возможна также секреция белков непосредственно в димерном состоянии [12, 13]. Большинство из них секретируются неклассическими путями, и для их секреции требуется неизвестный трехмерный сигнал распознавания.

Чтобы понять, на какой стадии происходит димеризация биназы, мы выдвинули два альтернативных предположения: либо фермент секретируется B.pumilus в форме мономеров, и их ассоциация происходит вместе с увеличением концентрации белка, или предварительно сформированный димер секретируется во внеклеточную среду. В пользу первой гипотезы можно привести многочисленные исследования физико-химических свойств биназы, выполненные различными исследовательскими группами, которые фактически не упомянули о существовании агрегированных форм фермента, а также кристаллографические исследования, которые не дали однозначного ответа на этот вопрос. вопрос об ассоциативных свойствах биназы [14–17].Кроме того, взаимодействие мономеров происходит во многих точках соприкасающихся поверхностей, поддерживаемых десятками слабых связей (гидрофобных, ионных и водородных), и фермент постепенно накапливается в культуральной жидкости; поэтому пространственные трудности могут гарантировать отсутствие димеризации в условиях низкой концентрации белка.

С другой стороны, гидратная оболочка белка может экранировать его полярные фрагменты и предотвращать олигомеризацию белка. Это говорит о том, что димеры биназы, обнаруженные в культуральной жидкости [8], должны образовываться сразу после секреции.Следует отметить, что способность образовывать мультимеры была установлена ​​для предшественников протеиназ, секретируемых Bacillus [18].

Настоящая работа была проведена для анализа возможности существования для природных мономерных форм секретируемой РНКазы B. pumilus . Их наличие однозначно подтвердит первое из наших предположений. Если мономеры образуются только на стадии трансляции и их олигомеризация происходит внутриклеточно или на клеточной стенке грамположительных бацилл, такие данные снимут все вопросы о неоднозначности и противоречии ранее полученных результатов о надмолекулярной структуре биназы.

2. Материалы и методы

2.1. Фермент

Биназа представляет собой катионную гуанилпредпочтительную РНКазу (pI 9,5), гидролизующую РНК без использования ионов металлов и кофакторов. Он состоит из 109 аминокислотных остатков с молекулярной массой 12,3 кДа. Биназу выделяли из культуральной жидкости B. pumilus и очищали в соответствии с процедурой, ранее описанной для бациллярных РНКаз [19, 20]. Каталитическая активность биназы составляла 1,4 × 10 ⁷ Ед / мг при измерении относительно высокомолекулярной дрожжевой РНК при pH 8.5 и 37 ° С [4]. Одна единица активности РНКазы была определена как количество фермента, которое увеличивает угасание растворимых в кислоте продуктов гидролиза РНК при 260 нм на одну единицу в минуту, измеренное при 37 ° C и pH 8,5.

2.2. SDS-PAGE

Белковые олигомеры разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии 0,1% SDS. Разделительный гель содержал 15% акриламида, а штабелирующий гель содержал 6% акриламида. Образцы белка суспендировали в 4-кратном буфере для образцов с конечной концентрацией SDS 1%, 1.5% и 2%. Электрофорез проводили при 150 В в течение 60 мин. Белки окрашивали кумасси R-250.

2.3. КД-спектрометрия

Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли в диапазоне длин волн 190-260 нм на спектрометре Jasco J-1500 (Япония) со скоростью сканирования 50 нм / мин. Биназу обессоливали и переносили в 0,01 М натрий-фосфатный буфер, pH 7, с использованием колонок Zeba 7 кДа. Концентрацию исходного раствора биназы определяли после фильтрации через 0.22 Пористая мембрана µ м с использованием коэффициента экстинкции E ₂₈₀ ^0,1% = 2,205. Кварцевые кюветы с оптическим путем 0,01 см и 0,1 см использовали для исследования концентраций ферментов 1 и 0,05 мг / мл соответственно. Кюветы термостатировали при 25 ° С. Содержание элементов вторичной структуры белков определяли с помощью алгоритма CDSSTR (набор белков 4) с использованием сервера DichroWeb (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

2.4. УФ-спектрометрия

Спектры поглощения записаны на приборе Lambda 25 (Perkin Elmer, США) в диапазоне длин волн 190–400 нм при 25 ° C.Растворы готовили так же, как и для измерений КД. Исходные растворы в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,1 или 0,1 М K ₂ SO ₄ , pH 3,0 титровали непосредственно в кварцевой кювете размером 1 см с тем же составом буфера. Расчеты с использованием онлайн-сервера http://protcalc.sourceforge.net/cgi-bin/protcalc показали, что при этих значениях pH биназа несет общий положительный заряд +5 и +16 соответственно.

2,5. Измерения самодиффузии

Метод самодиффузии ЯМР применялся для прямой оценки гидродинамического размера [21, 22] биназы при кислом и нейтральном pH.Образцы исследовали при концентрации белка 1,5 мг / мл при pH 3,0 и pH 6,4 путем растворения порошка белка в D ₂ O, чтобы минимизировать сигнал протонов воды в спектрах ЯМР. ¹ Н-ЯМР-эксперименты проводили на спектрометре ЯМР AVANCE III (Bruker, Германия), работающем на частоте 600,13 МГц. Спектрометр был снабжен стандартной головкой зонда с обратным z-градиентом (TXI, трубка 5 мм), способной создавать градиенты с максимальной силой 55,7 Г / см. Мы использовали последовательность стимулированного эха, включающую биполярные градиентные импульсы и задержку продольного вихревого тока (BPP-LED) [23].Параметры эксперимента были следующими: длительность импульса 90 ° 10-13 мкм с; спектральная ширина 13 ppm; точки данных во временной области 16-32 К; количество сканирований 16 задержка рециркуляции 2-5 с. Амплитуда градиента поля изменялась от 2% до 98% от его максимального значения с шагом 16-32 при постоянном времени диффузии (Δ = 50 мс) и длительности импульса градиента ( δ = 6-12 мс). Использовались задержка восстановления градиента 0,1 мс и задержка на вихревые токи 5 мс. Обработка данных и анализ выполнялись с помощью Bruker Topspin 3.5 программное обеспечение. Область химического сдвига для измерения коэффициента самодиффузии была выбрана в верхней области спектра, которая содержала сильные протонные сигналы при 0,7-0,9 м.д.

2.6. Статистика

Каждый эксперимент проводили в трех повторностях. Статистические различия были проанализированы стандартными методами с использованием Microsoft Excel 2007.

3. Результаты

3.1. Электрофорез выявил мономеры и димеры биназы в зависимости от концентрации белка

Электрофорез биназы, проведенный при низких концентрациях фермента (менее 50 нг) в присутствии 0.1% SDS не показал димерных полос (). Определение каталитической активности биназы в этих концентрациях в геле подтвердило присутствие только мономерных форм (). Однако увеличение концентрации биназы позволило обнаружить ее димер даже при увеличении концентрации SDS до 2%. Более того, использование сильных денатурирующих агентов, таких как мочевина или гуанидинхлорид, не привело к исчезновению полосы димеров биназы, что указывает на то, что концентрации микромолярных ферментов облегчают идентификацию димеров биназы даже в сильных денатурирующих условиях ().

Электрофоретическое исследование биназы. (а) Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) с 0,1% SDS при наноконцентрациях фермента (M, маркеры молекулярной массы). (б) Зимограмма биназы при наноконцентрациях. (c) ПААГ биназы при микроконцентрации (10 мкл г) в присутствии сильных денатурирующих агентов: 1 — 1,5% SDS; 2 — 2% SDS.

Можно предположить, что определенное соотношение между белком и денатурирующим агентом позволяет полностью разрушить димерную структуру биназы.В условиях, когда были видны только мономеры, приблизительное соотношение SDS / белок было более 1000, тогда как при обнаружении мономеров и димеров оно было немного больше 100 (рассчитано согласно фигурам и). Также возможно, что белок образует нестабильные димеры при низких концентрациях, подверженных распаду из-за действия SDS. Высокие концентрации биназы позволяют образовывать высокостабильные димеры, которые не диссоциируют даже в присутствии денатурирующих агентов.

Вероятно, решающее значение имеет соотношение нестабильных димеров биназы к высокостабильным димерам обмена, которые одновременно присутствуют в среде.Согласно данным, полученным для димеров РНКазы спермы быков (BS-РНКазы), соотношение замененных и не замененных димеров составляет 3: 7 [21]. Аналогичную зависимость можно предположить и для биназы. Следовательно, при низких концентрациях фермента (менее 100 нг) видны только мономеры, возникающие в результате диссоциации непереключенных димеров (рисунки и). С увеличением концентрации белка количество стабильных димеров с заменой мест увеличивается, что делает их обнаруживаемыми в геле ().

3.2. Спектроскопия КД не показала конформационного перехода белка при увеличении концентраций биназы

Сравнение спектров КД биназы при двух исследованных концентрациях (0.05 мг / мл и 1 мг / мл) при pH 7 не показали значительных различий в форме спектров (), кроме некоторого разброса спектральных данных ниже 200 нм. Проверочные измерения показали, что интенсивность полосы 190 нм варьируется в зависимости от поглощающих свойств буфера, что связано с уменьшением отношения сигнал / шум из-за влияния остаточных ионов соли, которые не были полностью устранены во время обессоливания белка. Однако мы не обнаружили разницы в составе вторичной структуры для двух концентраций белка ().Таким образом, спектры КД указывают на отсутствие значительных изменений вторичной структуры биназы и ожидаемого конформационного перехода мономер-димер при изученных концентрациях.

Спектры КД биназы в единицах молярной (по остатку) эллиптичности (а) и относительного содержания элементов вторичной структуры биназы (б) для концентраций фермента 0,05 мг / мл (темные) и 1 мг / мл (светлые символы) ), pH 7.

3.3. Биназа не проявляла гипохромного эффекта УФ-поглощения в диапазоне концентраций 0-50

Для биназы линейная зависимость поглощения при 220 нм от концентрации фермента в диапазоне от 0 до 50 µ г / мл и pH 6.1 был установлен (). Лизоцим в аналогичных условиях проявлял гипохромный эффект при концентрациях белка, превышающих 20 мкг / мкг / мл [24, 25]. Основываясь на наших предыдущих результатах водородного обмена и данных ЯМР [26], мы предположили, что увеличение заряда биназы при повышении кислотности раствора до pH 3,0 сместит равновесие между димерами и мономерами и вызовет изменения оптических свойств раствора. . Однако оптическая плотность в максимуме поглощения пептидных групп (216 нм) имела линейную зависимость от концентрации вплоть до 0.05 мг / мл, и погасание не зависело от значения pH (). Таким образом, HE не наблюдался в исследованном диапазоне концентраций биназы как для pH 3,0, так и для pH 6,1, что свидетельствует о неизменности супрамолекулярной структуры биназы и отсутствии перехода мономер-димер.

Изменения поглощения раствора биназы при 216 нм при pH 6,1 (светлые символы) и pH 3 (темные символы) в зависимости от концентрации белка.

3.4. Гидродинамический радиус, подтверждающий существование биназы в димерной форме

Для водных растворов коэффициенты самодиффузии биназы D = 1.26 × 10 ^-10 м ² / с и D = 1,38 × 10 ^-10 м ² / с были получены для pH 2,8 и pH 6,4 соответственно. Коэффициент самодиффузии частицы тесно связан с размером молекулы, как видно из уравнения Стокса-Эйнштейна:

, где k — постоянная Больцмана, T — температура, а r — эффективный гидродинамический радиус частицы (белка). (Радиус Стокса) в растворе с вязкостью η . По этому уравнению получены гидродинамические радиусы молекул биназы в растворах r = 2.01 нм (pH 3,0) и r = 2,14 нм (pH 6,4). изображает средний гидродинамический радиус r = 2,1 нм (штриховая сфера) в сравнении с результатами компьютерного структурного моделирования биназы [8].

Модель димера биназы [8] и экспериментальный гидродинамический размер (R = 2,1 нм) белка, определенный с помощью методов ЯМР.

Теоретический размер глобулы мономера биназы составляет 1,6 нм. Увеличение гидродинамического радиуса в 1,2-1,3 раза соответствует образованию димерной формы белка () по соотношению: D = (n) ^-1/3 , где D — коэффициент самодиффузии, а n — степень олигомеризации [27].Небольшие различия в величине эффективных радиусов, измеренных при pH 2,8 и pH 6,4, могут быть связаны с различиями в степени гидратации воды и электростатических взаимодействий между молекулами белка.

4. Обсуждение

Многие РНКазы склонны к образованию олигомерных структур. РНКаза А поджелудочной железы крупного рогатого скота, лиофилизированная из 40% раствора уксусной кислоты, образует димеры, тримеры, тетрамеры и мультимеры более высокого порядка [28, 29]. РНКаза спермы быка (BS-РНКаза), фермент с молекулярной массой 27 кДа и изоэлектрической точкой 10.3, представляет собой смесь природных димеров двух типов [30]. Димеры первого типа образованы ковалентными дисульфидными связями между аминокислотными остатками Cys31 и Cys32, тогда как преобладающие димеры второго типа дополнительно стабилизируются обменом N-концов [31]. Биназа, а также BS-РНКаза, РНКаза A и человеческая панкреатическая РНКаза H содержат гидрофобные фрагменты, способные участвовать в димеризации [32], но не содержат серосодержащих аминокислот для ковалентного сшивания димеров. Измененная форма BS-РНКазы сохраняет свою димерную структуру даже при разрыве дисульфидных связей [33].Хотя структура РНКазы из ооцитов Rana pipiens , онконаза, также стабилизируется во время сворачивания через дисульфидные связи [34], недавно открытые димеры онконазы образовывались путем перекрывания доменов [35].

В первых работах, описывающих олигомеризацию лизоцима, было показано, что ключевым моментом для этого процесса является ионизация аминогруппы активного центра (Glu35), которая имеет высокую константу равновесия диссоциации кислоты (pKa 6.2) из-за ее гидрофобности. окружающая среда [24].Важной характеристикой самоагрегации лизоцима была его зависимость от pH [36, 37]. Для биназы снижение доступности пептидных групп для молекул растворителя и усиление межмолекулярных электростатических взаимодействий, приводящих к частичной ассоциации белков, было продемонстрировано с использованием методов водородного обмена и ЯМР-релаксации с увеличением pH от 2,5 до 6,0 [26]. Авторы цитируемой статьи показали, что в кристаллах биназы, где один активный центр заблокирован, две карбоксильные группы (Glu43, Glu59) теоретически могут участвовать в олигомеризации.Glu43, расположенный на поверхности белковой молекулы, имеет гидрофобное окружение (Phe81, Ser37, Ser79) и высокое значение pKa, что делает его потенциальным аналогом Glu35 лизоцима, участвующего в образовании димеров.

Стереоспецифическая комбинация гидрофобности и взаимодействия β -доменов играет ключевую роль в олигомеризации белков. В переходных состояниях, предшествующих олигомеризации, домен α остается структурированным, а домен β теряет свою вторичную структуру [38].Биназа, сшитая диметилсуберимидатом, показала повышенную гидрофобность и более низкое содержание β -структур, что указывает на образование более стабильных димеров по сравнению с нативным ферментом, а не на переход мономера в димер, как это интерпретировалось ранее. [39]. Мы описали две правдоподобные модели димеризации биназы, одна из которых основана на ван-дер-ваальсовых и электростатических контактах, а другая стабилизируется в основном за счет электростатических взаимодействий; обе модели предоставляют возможность мономерам обмениваться концевыми доменами [8].Как видно из, некоторые димерные структуры были очень стабильными и не диссоциировали даже в присутствии сильных денатурирующих агентов (), а другие распадались на мономеры во время SDS-электрофореза (). Можно предположить, что наличие в составе высокоочищенного ферментного препарата нестабильных димеров, не обнаруживаемых при денатурирующем электрофорезе фермента в низких концентрациях, привело к тому, что биназа долгое время рассматривалась как мономер. Проведенный нами анализ спектров КД, оптической плотности в полосе поглощения пептидной группы и результатов ЯМР гидродинамического радиуса биназы показал неизменность вторичной структуры белка при переходе от низкого к высокому (до 1.0 мг / мл) и исключили присутствие мономера в препарате биназы (рисунки и). Таким образом, оптические методы подтвердили нативную димерную структуру биназы и наше второе предположение о том, что B. pumilus секретирует димерный белок в окружающую среду. Благодаря сигнальной последовательности Sec биназа перемещается через клеточную мембрану в развернутом состоянии. Димеризация фермента, вероятно, происходит во время сворачивания или когда он проходит через клеточную стенку B. pumilu s, что приводит к обнаружению димеров биназы только в культуральной жидкости независимо от концентрации РНКазы [8].Пропептиды бактериальных гидролаз предотвращают активацию ферментативной функции белков до момента транслокации и катализируют сворачивание секретируемых ферментов после их переноса через цитоплазматическую мембрану [40, 41]. Белки обычно проходят через клеточную стенку путем пассивной диффузии [10]. Bacillus spp. используют S-слой на поверхности своих клеток как трехмерную сетку для самосборки секретируемых белков [42]. Следует отметить, что наличие такого компонента клеточной стенки, как N-ацетилглюкозамин, не устраняет димеризацию лизоцима [43], как предполагалось ранее [24].Этот факт косвенно подтверждает стабильность димерной формы секретируемой биназы при ее диффузии через клеточную стенку грамположительных бацилл.

5. Выводы

Таким образом, очистка биназы из культуральной жидкости B. pumilus всегда приводит к приобретению димеров. Мономер может быть получен путем осуществления определенных аминокислотных замен в сайтах димеризации биназы с использованием метода сайт-направленного мутагенеза. Этим методом был получен мономерный вариант природного димера BS-РНКазы с полностью сохраненной каталитической активностью и 30-кратной цитотоксичностью по сравнению с димером дикого типа [44].Синтетический димер BS-РНКазы, созданный на его основе, также продемонстрировал повышенную цитотоксичность по сравнению с природным димером [44], противоопухолевая активность которого в восстанавливающей среде цитозоля обусловлена ​​только нековалентной замененной формой BS-РНКазы [30, 33] . Тем не менее цитотоксичность синтетического димера была ниже, чем у мономерной формы. Таким образом, получение мономера биназы открывает возможности для раскрытия точных механизмов противоопухолевого действия биназы и поможет определить вклад супрамолекулярной структуры РНКазы в ее цитотоксичность.

Благодарности

Работа Ольги Ильинской, Веры Ульяновой, Ирины Лисевич и Елены Дудкиной выполнена в рамках Государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и частично поддержана грантами РНФ [грант № 14–14- 00522] (идентификация димеров и мономеров) и РФФИ [номер гранта 17-00-00060] (спектры КД). Работа Наталии Захарченко, Александры Кусовой, Джигангира Файзуллина и Юрия Зуева поддержана грантом РФФИ №.18-415-160011 (эксперименты ЯМР).

Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения результатов этого исследования, включены в статью.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Список литературы