Дивизионизм /divisionnisme | ART Узел

от техники «раздельного мазка» — diviser /фр./ – делить (1891-1920)

Живописный метод, основанный на целенаправленном разложении сложного цветового тона на спектрально чистые цвета, которые точками различной конфигурации наносятся на холст, а затем при восприятии картины зрителем с определенного положения оптически сливается в нужный художнику цвет. Дивизионизм противопоставил беспорядочности и хаотичности мазков импрессионистов четкую систему вычисления и наложения точек, что делало работу художника очень сложной и трудоемкой, а способ письма строгим и сухим, но в тоже время привел к эффекту создания более интенсивных цветов, тонов и света в живописи. Итальянский дивизионизм родился одновременно с французским неоимпрессионизмом. Он разделял с ним оптическую теорию, но пользовался ею более свободно и эмперически. Дивизионизм питали почвенные традиции, в частности колористические и атмосферные поиски ломбардской Скапильятуры и натурализм тосканских макьяйоли (школа живописи «Macchiaioli»). Первым стал использовать раздельные мазки Джованни Сегантини в 1886 году, побуждаемый Витторе Грубичи. Триеннале 1891 года в галерее Брера — принятая дата начала дивизионизма. Марбелли писал: «С разделением цвета мы видим не собственный цвет материи, а окрашенные лучи, и с этой переменой, живопись становится более одухотворенной». Позитивистская концепция, породившая живописную технику, стала опорой иного, идеалистического видения. Построение формы мелкими точками (Морбелли и Пелицца) или тончайшими линиями (Превиати и Сегантини) — это ductus, живописный прием, который позволяет вызнать тайны устройства реальности и создать ее заново — уже преображенной и свободной от материальной тяжести. Картины дивизионистов всегда кажутся некими видениями: и в том случае, когда их сюжеты связаны с натурой, и тогда, когда когда приближаются к тематике символистов, как у Сегантини, и тогда, когда обращены к социальным проблемам, как у Пелицца.

Художники: Джованни Сегантини (Giovanni Segantini), Джакомо Балла (Giacomo Balla), Эмилио Лонгони (Emilio Longoni), Анджело Морбелли (Angelo Morbelli), Плинио Номеллини (Plinio Nomellini), Джузеппе Пелицца да Вольпедо (Giuseppe Pellizza da Volpedo), Гаэтано Превиати (Gaetano Previati).

Выставка: 1891, Милан, Триеннале ди Брера.

Тексты: Дж.Пелицца «Дивизионизм, как техника», 1896; Г.Превиати «Научные принципы дивизионизма», 1906.

См. также статьи: Неоимперессионизм, Футуризм, Символизм.

Описание некоторых произведений:

Джванни Сегантини «Дурные матери», 1894. Холст, масло. Вена, Австрийская галерея. Тема материнства, которая у Сегантини была тесно связаня с природой, здесь представлена негативно. Эта работа посвящена теме абортов. Изображены вечные муки женщин, сделавших аборт. Дурные матери (они таковы, потому что бездетны) с младенцами, приникшими к груди, привязаны к засохшим деревьям в пустынном и ледяном пейзаже.

Джванни Сегантини «Дурные матери», 1894

Гаэтано Превиати «Материнство», 1891. Холст, масло. Новара, Банко Пополаре ди Новара. Картина была выставлена на Триеннале в галерее Брера в 1891 году, а год спустя в Париже в салоне Роз-Круа. «Материнство» соединяет эмоциональное напряжение с живописными средствами, которые отводят реальность на второй план ради бестелесной и почти абстрактной прозрачности. В процессе работы над картиной Превиатти писал: «На холсте не должно быть ни красок, ни форм (неба, луга, женских или мужских фигур), а лишь возглас — fiat (божье слово, да будет): «поклонитесь матерям». Движения ангелов, которые окружают Мадонну с младенцем, передаются направленными движениями кисти. Формы тел моделируются нитевидными мазками — яркими и цветоносными, — что делает картину более похожей на легкий рисунок.

Гаэтано Превиати «Материнство», 1891

Джузеппе Пелицца да Вольпедо «Четвертое сословие», 1898-1901. Холст, масло. Милан, галерея современного искусства. Первоначальное название картины «Рабочие». Картина показывает авангард пролетариев. Крупный формат холста позволяет написать фигуры почти натуральной величины. Знаток трудов по оптике, Пелицца пользовался методом дивизионизма скорее как своеобразным техническим приемом. «Фактура, — писал он в 1898 году, — не должна состоять только из черточек, точечек, или просто быть красочным месивом; она не должна быть совершенно гладкой или слишком грубой, но изменяться в соответствии с разнообразием поверхностей реальных предметов и составлять «красноречивую гармонию» с формой и цветом.

Художественные приемы в акварельной живописи

Если вы всерьез решили заняться акварельной живописью, то без понимания некоторых приемов нанесения краски, вам не обойтись.

Мазки
Акварельная живопись более текуча, так как в ней используется много воды, поэтому мазки, как таковые, не являются ее основным приемом. Однако при помощи мазков можно добиться большей динамики в работе, а также выработать свой определенный узнаваемый стиль.
При выполнении мазка кисть с пигментом ставится в нужную точку и совершается движение в нужную вам сторону с нужным нажимом, после чего кисть отрывается от бумаги.
Стоит понимать, что максимальный эффект от мазка будет в том случае, если вы работаете с сухой бумагой или со слегка увлажненной, тогда мазки будут выразительнее. Чем суше кисть, тем больше пробелов остается на бумаге. Подобным приемом хорошо выписывать поврежденную поверхность стен (отвалившуюся штукатурку, разрушенную кладку), блики на воде или металлических крышах домов, проблески солнца в листве.
Для мазков можно использовать кисти с разным сечением, все они дают разную структуру и форму мазка.

Акварель К. Куземы

Заливка
Заливка обычно используется в масштабных работах, чтобы закрасить максимально большую площадь бумаги. Заливка делается в «мокрой» технике. Лист бумаги, располагающийся под наклоном, смачивается водой при помощи флейца, на мягкую кисть набирается краска и проводится мазок от начала листа до его конца. Затем на кисть вновь набирается краска (возможно другого цвета) и проводится следующий мазок, частично перекрывающий предыдущий. Это позволяет делать равномерный фон с плавным переходом от цвета к цвету. Обычно заливкой рисуют небо.

Заливка в исполнении В. Калачевой

Растяжка цвета
Растяжка это переход от темного участка к светлому или наоборот. По сути, это та же заливка, техника выполнения у них одинакова, только растяжка делается той краской, которая собирается внизу полосы в виде капли с добавлением в кисточку чистой воды, тем самым разбавляя цвет и сводя его на нет.

Вытягивание
Прием для осветления участков работы. Выполняется до того, как работа высохла. Отжатую чистую кисть прикладывают на место, где нужно осветлить и она вытягивает из бумаги воду и пигмент. Вытягивание используется не только в качестве художественного приема, им также правят неудачные места. Конечно максимально удобно пользоваться им в техниках «по-сырому». Например, на заливке неба «вытянуть» легкие облачка. А вообще, вместо кисти можно воспользоваться салфеткой.

Если краска на работе уже просохла, то используют прием вымывания. Это близко к вытягиванию, но с одним лишь отличием — на нужный участок предварительно наносят воду, которую потом собирают чистой сухой кистью. Это позволяет вымыть частички пигмента с листа. Конечно же вода для вымывания должна быть чистой. И кистью при вымывании и вытягивании мы по бумаге не елозим, а нежно и мягко касаемся, не образуя затертостей.

Отмывка
Отмывка — очень интересный прием, который популярен среди дизайнеров и тех, кто занимается архитектурной иллюстрацией. Суть приема заключается в том, что берется краска одной концентрации и наносится несколькими слоями на рисунок так. В первый слой делается основной цвет, во второй слой обозначают полутона, а в третий слой добавляют детали. Более трех слоев наносить не рекомендуется, потому что рисунок начинает грязнить. И да, всегда нужно дождаться полного высыхания предыдущего слоя, потому что растекание краски и выход за четкий контур в дизайнерской иллюстрации не приветствуется. Прием очень техничный, мастера отмывки могут добиваться настолько натуралистичного рисунка, что его часто принимают за фотографию.
Отмывка выполняется очень мягкими кистями, преимущественно беличьими. Предварительно бумага, натянутая на планшет, смачивается водой, но не до блеска, а до такого состояния, когда при касании рукой она просто прохладная. Кисть с пигментом отмывают об бумагу так, чтобы внизу мазка оставалась капля, которая потом убирается отжатой кистью. Краски на кисточке должно быть ровно столько, чтобы хватило провести сплошную линию от края до края. Если ее будет меньше, то возникнет прерывистая линия, если больше, то капли стекут за контур рисунка.
Отмывка требует точности и аккуратности. Кисть не должна попадать уже в нанесенный слой, потому что своим ворсом она вымывает частички пимента и слой становится с ненужными вкраплениями и полосками. Все исправления делаются по высохшим слоям. Ничего не напоминает? Правильно, лессировку!

Кроме акварели, отмывка выполняется тушью для рисования.

Резерваж
Само по себе это слово уже объясняет назначение этой техники — резервирование белых участков бумаги для  того, чтобы использовать ее вместо белой краски (помним, что белой краски в акварели вообще не существует). Резерваж можно делать путем специальных маскирующих жидкостей, восковых мелков, а также путем физического приема  обводки.

Маскировочная жидкость хороша тем, что позволяет художнику не задумываться над «аккуратностью» и точностью мазка. Она покрывает те места, где должны быть блики или облака или любая другая белая поверхность, и художник может не опасаться, что случайно замажет это место. Кроме того, маскирующей жидкостью можно покрывать уже высохшие слои краски, чтобы сохранить нужный оттенок. В основном она используется для прорисовки тонких деталей.
Вместо маскирующей жидкости можно использовать и восковой мелок. Только разница между ним и жидкостью заключается в том, что мелок удалить невозможно, в то время, как маскирующая жидкость удаляется с работы после ее окончания. Мелок дает неровную линию, высокой четкости, как от жидкости, добиться от него невозможно.
Минусом маскирующей жидкости является то, что наносить ее нужно кистью, которую не жалко, потому что жидкость из нее не вымывается. Также предварительно можно смазать кисть мылом или востользоваться апельсиновой палочкой для маникюра.

Резерваж маскировочной жидкостью (слева) и восковым мелком (справа)

Рисунок из пособия Манухова И. А для студентов вузов, обучающихся по направлению «АРХИТЕКТУРА»

Обводка — это вершина мастерства художника, когда он тщательно обходит кисточкой те места, где должны быть блики или белый цвет.

Цветных вам понедельников, друзья!

Техника темперной живописи

 

Техника темперной живописи

 

Успешность в работе темперой, как и в любой другой технике, во многом зависит от наличия необходимых принадлежностей.

Кисти для темперной живописи нужно иметь колонковые и щетинные. Очень хороши в работе плоские колонковые кисти. После работы их надо тщательно промыть в теплой воде с мылом.

Палитры в темперной живописи применяются фарфоровые или белые эмалированные. Они должны иметь по краям не менее двенадцати лунок для красок. Центральная часть служит для смешивания красок. Воду можно налить в банку, которую укрепляют на палитре или располагают рядом. После окончания работы необходимо тщательно очистить палитру от оставшейся краски, смыв ее губкой или тряпкой.

Этюдник нужен такой же, как и для масляной живописи, с той лишь разницей, что палитра для красок будет не деревянная, а фарфоровая или эмалированная.

Перед тем как приступить к выполнению этюда красками (как темперой, так и гуашью), необходимо в рисунке композиционно решить размещение всех элементов будущего изображения, построить предметы с учетом их расположения в пространстве. Рисунок в данном случае носит вспомогательный характер, поэтому рекомендуется избегать резких и толстых линий, которые могут быть впоследствии заметны при покрытии тонкими красочными слоями.

Варианты общей композиции удобно искать в предварительных небольших набросках, добиваясь выразительности расположения объектов в том или ином формате листа, ясности тональной и цветовой задачи. Если рисунок под темперную живопись выполняется углем на грунтованном холсте, то его фиксируют раствором желатина.

Живопись начинают с тонкослойных прокладок крупных участков этюда. Если в акварели рекомендуется работу вести от светлых тонов к темным, то в темпере нужно одновременно в полную силу тона намечать и темные места изображения. Соблюдая принцип «

от общего к частному», от крупных форм переходят к выявлению нужных деталей, не упуская цельности больших цветовых масс.

В темперной, как и в масляной живописи, следует меньше употреблять белил при написании теневых участков формы, добиваясь тем самым звучности и активности цвета.

Темперная живопись позволяет применять разнообразные приемы, включая технику письма по сырому, многослойную живопись, раздельными мазками как пастозно, так и тонкими, почти прозрачными слоями.

В краткосрочных этюдах темперой цветовые отношения нужно брать сразу во всю силу, для чего используют технику alla ргimа, решая форму в один прием без расчета на дальнейшую прописку.

Темперу хорошо использовать и в качестве подмалевка под масляную живопись, так как она позволяет путем больших покрытий решать в начальной стадии крупные цветовые массы, организуя колорит всей картины.

Если перед художником стоит задача передать тонкие тональные переходы (например, в изображении облаков, отражения в воде, в трактовке крупных складок одежды, в решении предметов дальнего плана и т. д.), уместно применить письмо по сырому, то есть по смоченному холсту или по только что прописанному участку, используя при этом мягкие соединения смежных тонов. Такой способ рекомендуется также при передаче теневых участков натуры, которые отличаются обобщенностью, отсутствием резких границ формы. Работу лучше вести без белил.

Письмо с помощью пастозного раздельного мазка рекомендуется при передаче освещенных мест там, где имеются довольно контрастные тональные отношения, где требуется передать четкие границы формы, выявить материал предмета. При этом надо стараться не забивать фактуру холста.

Положенный на холст мазок должен убедительно передавать натуру, но не быть самоцелью. У начинающего живописца иногда появляется соблазн работать «красивым мазком», без учета характера изображаемых форм и требуемого решения этюда.

Темперные краски

Нетрадиционные техники рисования – средство развития творческих способностей детей

Е. Максимова, педагог дополнительного образования, г. Сыктывкар, Республика Коми

Ребёнок, поступая в школу, вовлекается в продуктивную познавательно-творческую деятельность, где, с одной стороны, он выступает в качестве ведомого взрослым и через различные методы и приёмы включается в освоение художественного опыта; с другой стороны, пробует себя в качестве художника-творца. Это требует от него творческого воображения и осмысленных действий, самостоятельности, умения применять опыт в новых условиях, ответственно относиться к собственной деятельности и деятельности сверстника, а также к получаемому продукту (результату).

В настоящее время для развития творческих способностей детей педагоги ИЗО, наряду с традиционными техниками рисования, активно используют и нетрадиционные. Применение таких техник способствует обогащению знаний и представлений детей о предметах и их использовании, материалах, их свойствах и способах применения.

Исходя из разнообразия рисовальной техники и учитывая возможности детей старшего дошкольного и младшего школьного возраста, педагоги нашего Центра решили обогатить техническую сторону детского рисования. Этого можно достигнуть, если разнообразить способы работы с такими известными в широкой практике изобразительными материалами, как гуашь и акварель (растяжка цвета, по-сырому, вливание цвета в цвет, техника раздельного мазка), овладевать различными приёмами работы кистью (всем ворсом, концом, примакиванием, тычком сухой жёсткой кистью), использовать нетрадиционные техники (монотипия, ассамбляж, кляксография), где линия, контур, пятно — выразительные средства рисунка, и, таким образом, подводить детей к сочетанию в одном рисунке разных техник и изобразительных материалов.

Одной из интереснейших нетрадиционных техник, включенных в процесс обучения детей в нашем Центре, является ассамбляж (франц. assemblage, соединение). Это техника современного искусства, родственная коллажу, но использующая объёмные детали или целые предметы, скомпонованные на плоскости картины. Здесь допускаются живописные дополнения красками, а также металлом, деревом, тканью и другими структурами. Техника ассамбляжа иногда применяется и в других произведениях, от фотомонтажей до пространственных композиций, поскольку терминология новейшего искусства не вполне устоялась.

Актуальность занятий ассамбляжем обусловлена тем, что в этом искусстве, как и в коллаже, фантазия детей абсолютно ничем не ограничена: можно использовать сочетания самых различных материалов, создавать любые линии, реализовать любые мечты и фантазии. Обучение ассамбляжу даёт детям возможность работать в смешанной технике. Здесь используются различные материалы — как природные, так и искусственные, приветствуется смешение фактур и игра объёмов, широко применяются художественные краски. Техника ассамбляжа интересна ещё и тем, что здесь каждый может использовать свои, свойственные только ему приёмы, и тогда на свет появляются неповторимые детские работы.

На занятиях по ассамбляжу мы выставляем перед детьми блюдо с гвоздями, шурупами, гайками, пружинами — металлическими модулями. Затем даём другое блюдо — уже со стеклянными модулями, разными по размеру и цвету кусками стекла овальной и треугольной формы, обязательно с покатыми краями.

Затем объясняем понятие ритма. Ритм — это чередование каких-либо элементов в определённой последовательности, средство композиции, с помощью которого можно, в частности, передать движение на плоскости. Ритм может быть задан линиями, пятнами света и тени, пятнами цвета и может строиться на контрастах объёмов.

Следует отметить, что гвозди и шурупы можно приобрести в хозяйственных магазинах, а вот стеклянные детали педагогу приходится готовить самому, без помощи детей.

Для этого кусочки битого бутылочного стекла синего, жёлтого, зелёного и красного цветов закладываем в муфельную печь для обжига керамики, затем печь нагреваем до +1000 градусов и даём медленно остыть.

Открываем дверцу печи и собираем с её дна разноцветные «капельки» — безопасный материал для создания картины в технике ассамбляжа готов.

Заранее нарезаются квадратные прямоугольники из оргстекла и выбираются из глянцевых журналов фото живых существ, которых решено изобразить, чтобы дать детям возможность передать движение.

Губкина Александра, 10 лет Бабочка.

Динер Мария, 10 лет Белочка.

Скороходова Лида, 9 лет Белочка.

Филиппова Софья, 8 лет Хамелеон.

Фотографии кладутся под оргстекло — основа для картины готова. Затем каждый ребенок выбирает, с каким материалом он будет работать — с цветным стеклом или металлическими деталями. После этого дети приклеивают прозрачным клеем-моментом «Кристалл» свои «картины» к оргстеклу. В первый раз на занятие по ассамбляжу уходит два академических часа, так как детям нужно выработать навыки работы в новой для себя технике. Здесь сложность возникает при работе с клеем — он «тянется» и часто оставляет следы на стекле.

Для юных художников в нашей северной республике один из самых популярных персонажей — белка: когда-то наши предки платили дань царям именно шкурками этих животных. Теперь их в наших лесах гораздо меньше, чем на детских рисунках.

Трудно изобразить мех с помощью металлических деталей! «Пушистость» передаём, выкладывая в определённом ритме волосики меха из небольших тонких гвоздей. Экспериментируя, дети находят свой, индивидуальный ритм: белку Маши Диннер не спутаешь с белкой Лиды Скороходовой, хотя обе выбрали одну и ту же фотографию в качестве образца.

Маленькая, но храбрая Соня Филиппова выбрала самый сложный объект для изображения — хамелеона: поэкспериментировав с гвоздями и шурупами, укладывая их под разными углами, смогла передать с их помощью чувство угрозы, встревоженности экзотического зверька, показав начатое им движение.

Не все дети копируют выбранные картинки из журналов. Кристина Шоль, на уроках по стилизации уже рисовавшая махаонов, выложила прекрасную бабочку без картинки под стеклом, опираясь только на свою фантазию.

Обычно дети любят выполнять картины с бабочками, белочками и цветками. Однако Руслан Кулаков традицию нарушил: принёс из дома фотографию автомата Калашникова и мужественно его выполнил, несмотря на поддразнивания девочек. Однако уступил им в малом — украсил оружие гламурным бантиком.

Наши девочки-художницы совсем не воинственны. Они если и стреляют, то только глазками. Вот Ира Григоренко, в пику Руслану, и решила изобразить «Взгляд» — вот так, именно с большой буквы. А реснички сделала разноцветными, важно пояснив, что теперь тушь для глаз выпускается самых разных оттенков.

Одной из интереснейших нетрадиционных техник, помогающей отрабатывать навыки работы красками и кистью, формировать умения передавать силуэтное изображение, является микс монотипии и кляксографии, который может дать изрядную пищу детскому воображению.

Кляксография воспитывает также способность к сопереживанию — её с успехом применяют психологи на коррекционных занятиях. Этот вид рисования помогает развить у детей глазомер и координацию. Техника кляксографии считается очень простой, однако мною она была модифицирована и теперь используется при обучении основам изобразительной техники в нашем Центре.

Обычно берётся плотный альбомный лист бумаги, разводится немного краски (акварель или гуашь) до жидкого состояния. Затем делается клякса — набирается краска в пипетку или на кисточку и капается на середину листа. В первом случае получатся цветные подтёки, во втором — красочные брызги. Затем начинаем дуть на кляксу из коктейльной трубочки — сверху, сбоку. Выдули первую кляксу — отложили лист в сторону. Посмотрели, на что она может быть похожа — на дерево, кота, собаку… Затем выдули ещё кляксу. И не забываем всегда рассматривать кляксу и фантазировать. Ненужные детали закрашиваем белой гуашью. Вырезаем понравившиеся образы и создаём из них композицию, приклеив её на отдельный лист.

Созданные композиции мы пропускаем через копировальную машину и изображение получаем на ватмане. Так получились, например, «Метаморфозы» (бирюза) и «Елочка» (малахит). При этом ксерокс оставляет только самое главное для будущего образа, «не замечая» мелких деталей. Для этого мы используем цветную бумагу «Крафт».

     
Сухарева Лена, 12 лет.  Метаморфоза  —  Ёлочка

Здесь в работу активно включается детская фантазия: обводка черной и серебряной гелиевыми ручками контуров угаданных образов. Для оживления образа цветом используем гуашь — это самая кропотливая и длительная часть работы над рисунком. Затем добавляем мелкие точки разноцветными фломастерами — они уравновешивают композицию.

В этой технике в студии «Дизайн» создано немало интересных работ, высоко оцененных на городских и республиканских выставках, показанных в Национальной галерее Республики Коми. Например, «Волшебная птица» Сони Филипповой, в которой птица была выделена пастелью, красочно, но не контрастно, так как коричневый тон бумаги создавал воздух. «Кошку на прогулке» Настя Исакова выделила штрихом, яркими мазками расставив пятна на пестрой шкурке. «Пейзаж» Кристины Шоль сложился практически сразу, лишь были добавлены облака, ей даже удалось обойтись без пастели — у девочки поразительное художественное чутьё.

Жигалова Лена, 11 лет Улитка

Лодыгина Наташа, 11 лет Птеродактиль

Как показали наши занятия, монотипия и кляксография — чудесный микс, который может дать пищу детскому воображению и позволяет создать выразительные картины. Получившиеся в процессе использования этих техник детские работы объединяет то, что цвет не описывает качества предметов, а служит самостоятельным выразительным средством рисунка. Цветовые пятна пульсируют, переплетаются в причудливом ритме крупных и мелких форм и порождают в юных головках реальный образ пейзажа или портрета.

Здесь доминирует не раскрашивание привычных объектов, не раскладка объёма на свет и тень, а эмоция, настроение, образ, выраженные через реалистичные формы. Было выявлено, что на активизацию творческих проявлений детей при использовании вышеописанных техник влияет рассматривание репродукций картин, восприятие музыкальных и литературных произведений, способствующих обогащению эмоциональной сферы и развитие воображения ребёнка. Кроме того, важны непосредственное наблюдение живой природы и её объектов и уточняющие беседы с детьми об увиденном.

Таким образом, осваивая разнообразные нетрадиционные техники, ребёнок познаёт различные способы изображения уже знакомых предметов и явлений, совершенствуется его зрительное восприятие, закрепляются навыки рисования, создаются условия для свободного экспериментирования различными изобразительными материалами. Однако использование нетрадиционных методов, приёмов и техник рисования не решает всех задач художественно-эстетического и творческого развития школьников. Поэтому, на наш взгляд, целесообразно использовать их, скорее, как вспомогательные, а не основные методы и приёмы работы с детьми. При этом не следует забывать о необходимости включения изобразительной деятельности в целостный педагогический процесс; соединения обучения с развитием самостоятельности, познавательной активности, эстетической восприимчивости детей и их эмоционального отношения к окружающему; взаимосвязи творческой художественной деятельности детей с их общим психическим развитием.

Курсы живописи, рисования в Киеве

Обучаем с нуля!

100% практики — теория выдается!

Занятия 1 раз в неделю!

 

Хотите научиться рисовать? Тогда наши курсы живописи это то что вам нужно! Только представьте: курс акварельной живописи, курс живописи маслом, рисование пастелью, и даже как рисовать акрилом! Этому всему Вы научитесь, посетив наши курсы рисования в Киеве. Приглашаем Вас окунуться в удивительный мир живописи в нашей школе рисования!

 

На базовом художественном курсе по живописи вы познакомитесь в теории и на практике с основными приемами написания картин масляными и акриловыми красками, акварелью и пастелью, и соответствующими принадлежностями и инструментами. Наши курсы живописи подходят для взрослых и начинающих. Вы познакомитесь с выразительными особенностями каждой техники. Изучите такие основополагающие понятия живописи как: тональность, светотень, создание иллюзии объема и глубины пространства на плоскости, законы взаимодействия и гармоничное смешение цветов. В клубе живописи научитесь основам конструктивного построения бытовых предметов и композиционным приемам. Сможете выполнять свободные копии с картин художников и по фото.

 

Обучение разным техникам рисования взрослых и детей.

 

Повышение мастерства возможно на мастер классах по живописи для всех желающих.

 

Чтобы почитать о преимуществах обучения в Клубе, нажмите тут.

 

Программа курса

«Живопись»:

1. Живопись. Выразительные средства живописи. Материалы и принадлежности. Масляная живопись. Понятие тона. Тоновая шкала и растяжка. Нюанс. Контраст. На уроке рисования шишем весенние цветы крокусы. Масло.
2. Изображение иллюзии объема на плоскости. Светотень. Построение цветка тюльпана. Компоновка . На уроке живописи пишем букет тюльпанов в реалистическом стиле. Масляная живопись.
3. Основы конструктивного построения предметов быта. Ось симметрии. Пропорции. Пишем чайный натюрморт. Масло.
4. Начинаем изучать свойства цветов и их смешивания. Цветовой круг. Основный и вторичные цвета. Родственные и дополнительные цвета. Понятие силуэта и силуэтной формы. Пишем пейзаж в технике «а-ля прима» с фото : масло.
5. Плановость в пейзаже. Понятие о перспективе. Воздушная перспектива. Изображение деревьев. Продолжаем изучать смешение цветов. Горизонтальный и вертикальный формат. Пишем пейзаж по мотивам картины И Левитана «Осенний пейзаж с церковью»: Масло
6. Послойное письмо и лессировка. Подмалевок. Получение разных оттенков зеленого цвета. Пишем летний пейзаж в технике послойного письма. Масло.
7. Заканчиваем летний пейзаж в технике послойного письма
8. Как написать небо с облаками. Виды облаков. Высокая, средняя и низкая линии горизонта. Пишем пейзаж по фото. Масло.
9. Свойства акриловых красок и соответствующие принадлежности. Пишем морской пейзаж с парусным кораблем. Акрил или масло на выбор.
10. Виды смешения красок. Оптическое смешение. Техника раздельного мазка. Пуантилизм. Пишем картину в технике раздельного мазка. Акрил или масло на выбор.
11. Пастель. Виды пастели и принадлежности для работы пастелью. Приемы работы. Рисуем этюд с виноградом. Сухая пастель.
12. Продолжаем знакомство с пастелью. Как выбрать цвет бумаги для пастельного рисунка. Рисуем пейзаж . Сухая пастель.
13. Продолжаем знакомство с пастелью. Как изобразить живые глаза. Рисуем портрет животного. Сухая пастель.
14. Продолжаем знакомство с пастелью. Черный фон. Рисуем букет маков. Сухая пастель. Опорные фото:
15. Акварель. Свойства акварельных красок. Принадлежности для работы. Виды бумаги для акварели. Техника «по-сухому» и «по-мокрому». Набрызг. Пишем цветок подсолнуха с пчелой или бабочкой с фоном.
16. Продолжаем знакомство с техникой акварели. Растяжка цвета. Вливание цвета в цвет. Протирки и отмывки. Как написать небо акварелью. Пишем несколько этюдов различного состояния неба.
17. Продолжаем знакомство с техникой акварели. Использование чистых и ярких цветов. Как избежать грязи в акварели. Пишем картину «Рыбки в пруду».
18. Продолжаем изучение техники акварели. Пишем горный пейзаж по мотивам картин художников.
19. Пишем картину с выбором техники и сюжета.
20. Продолжаем писать картину с выбором техники и сюжета. Учимся вариантам оформления акварельных и пастельных работ в паспарту самостоятельно.

Приходите на наш курс живописи, и мы научим вас рисовать в разных техниках.

Приглашаем Вас посетить нашу выставку рукоделия в учебном центре!

 

 

 

Запись на курсы

Предлагаем такой порядок записи на курсы:

Вы звоните нам, узнаете все о курсах, которые Вас интересуют, в т.ч. стоимость и наличие мест в той группе, которая Вас устраивает. Мы бронируем Вам место на 2 дня. Вы приезжаете к нам в Клуб, подписываете Договор на обучение и оплачиваете стоимость первого месяца обучения.

За одно Вы познакомитесь с распечатками уроков и выставкой рукоделия, на которой представлены работы наших учениц, созданные во время обучения на наших курсах!

 

Варианты оплаты стоимости курсов:

1. Вариант: Оплата первого месяца занятий — во время подписания Договора (без паспорта). Затем 4 платежа по месяцам, указываем даты в Договоре.
2. Вариант: Оплата первого месяца занятий – во время подписания Договора (без паспорта). Затем за 4-и месяца сразу на втором уроке обучения. Дату указываем в Договоре.
3. Вариант: Оплата всех 5-и месяцев обучения сразу во время подписания Договора или до начала занятий.

 

Наш адрес: Киев, м. «Лукьяновская», ул. Зоологическая, 6 (отдельный вход)
К нам лучше ехать от метро «Лукъяновская» 2 остановки трамваем (№ 14 или 15) или автобусом № 9 (556) или маршрутками № 14, 417, 566 до остановки «Зоологическая» или пройтись пешком — 10 минут.

 

Телефоны:

483-67-70
063-693-0261 (Лайф)
098-421-6719 (Киевстар)
099-405-1021 (МТС Viber)

 

Смотрите наш график работы и место расположения в контактах.

Добро пожаловать к нам на курсы!

Надеемся, Вам у нас очень понравится!

 

 

Курсы живописи | Курсы рисования

Изобразительные приемы и техники основная школа живопись) в УМК Изобразительное искусство. Основная школа

«Изобразительные приемы и техники
(живопись) в УМК Изобразительное
искусство. Основная школа»
УМК под редакцией
Шпикаловой Т.Я.
2019
Линейка 5-8 классы
2
Прием изображения объемов
Фактура: глянец
Фактура: бархатистость
Техника коллажа
Техника коллажа
Техника монотипии
Техника монотипии
Манера
Прием контрастов, нюансов, насыщенности цвета и вливание цвета в цвет
Изобразительные приемы и техники живописи в начальной школе
Прием красочного пятна и линии
Прием «раздельный мазок»
Прием «раздельный мазок» тычок-печатка
Прием «мазок по восковому рисунку»
Прием (цветного пятна, короткий и удлиненный мазок, линия)
Прием работы по сырой бумаге
Прием изображения объемов
Прием растяжения цвета
Техника рисования акварелью
Техника рисования гуашью
Техника монотипно-разового отпечатка с дорисовкой
Техника живописи по сырому (алла-прима)
Раздельный мазок, «по сырому», «алла прима», вливание цвета в цвет
Мазок
Мазок
Общие советы
1. Меняйте типы мазков. Не
используйте одни и те же мазки по
всей картине.
2. Направление мазка следует
выбирать в соответствии с
создаваемой плоскостью или формой.
3. Используйте мазки различных
типов – длинные, короткие, густые
фактурные или жидкие. Разводите
краску, смело наносите ее пятнами
или слоями, смешивайте или вливайте
непосредственно на бумаге.
Некоторые технические приемы И.К. Айвазовского
1. В небе и на дальних планах наносить краску едва заметным тонким слоем
2. На освещенных местах переднего плана и бликах на воде накладывать ее жирным
«вкусным» мазком
3. Налагать красочный слой очень живо, разнообразно и полностью подчинять форме,
через которую раскрывается содержание замысла картины. Большие плоскости, где
изображены спокойное небо с легкими прозрачными облаками или штилевая вода,
писать широкой кистью
4. Никогда не переписывать небо, оно всегда выполнялось в один прием. Это сообщает
небу большую легкость, прозрачность, а облакам – слитность, вписанность в
красочное «тесто»
5. При изображении воды широко прописывать форму волны
6. Большое значение придавать детальному окончанию работы. Завершающие
живопись мелкие детали: кружево освещенной или затемненной пены, блики света на
воде, камни и скалы переднего плана, детальная проработка оснастки парусных
кораблей – все это имеет немалое значение в получении правдивости общего
впечатления
Барсамов Н.С. Иван Константинович Айвазовский.1817-1900.
Право выбора техники
Прием – сочетание акварельной подцветки с графическими материалами
(скетчинг)
Монументально-декоративная живопись. Фреска, сграффито, граффити,
мозаика, витраж
Задачи
проекта
Техника — пуантилизм
Point-to-point (поинт-ту-поинт) точечная
роспись (дот-арт)– искусство декорирования
точками. Точки выстраиваются в линии,
образуя орнамент.
Рисунок
ватными
палочками,
фломастерами,
гелиевыми
ручками.
Цифровой циркулизм – синтез
поп-арта и пуантилизма.
Бен Хейне
Техника — пуантилизм
Техника – кубизм (прием геометризации формы)
Техника – лучизм
Изобразительные приемы и техники живописи в основной школе
Прием изображения объемов
Прием контрастов, нюансов, насыщенности
Прием вливание цвета в цвет
Живописный мазок
Прием сочетания акварельной подцветки с графическим материалом
Техника коллажа
Техника монотипии
Техника граффити, мозаики, витража
Техника: пуантилизм, кубизм, лучизм…. .
Компьютерные технологии (компьютерные графические редакторы)
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
ИНФОРМАЦИЯ
КОНТАКТНАЯ
Приобретение продукции:
Отдел по работе с госзаказами
Руководитель: Трофимова Галина Владимировна
Телефон: +7 (495) 789-30-40, доб. 41-44
E-mail: [email protected]
Отдел по работе с оптовыми клиентами
Руководитель: Кузнецова Анна Николаевна
Телефон: +7 (495) 789-30-40, доб. 40-76
E-mail: [email protected]
www.prosv.ru

Подготовка и исследование кожных мазков

Подготовка и исследование кожных мазков для печати (PDF- 225 КБ)

Карта мазка / биопсии кожи для печати (PDF-56 КБ)

Кожный мазок является ценным и экономичным инструментом повседневного ведения пациента с болезнью Хансена. Мазок — это средство оценки количества присутствующих кислотоустойчивых бактерий, которое обозначается как Бактериальный индекс (BI), и важно для определения типа и тяжести заболевания, а также для оценки реакции на лечение.

Общие

• Первоначальные мазки кожи обычно берутся с 6 «обычных участков» (мочки ушей, локтей и коленей), а также с нескольких типичных поражений пациента. Для оценки прогресса берутся повторные мазки с 3-х до 4-х наиболее активных участков, ранее протестированных.
• Временной интервал между повторными взятиями мазков определяет врач, но в целом годовые мазки достаточно для мониторинга реакции на лечение и в течение периода последующего наблюдения для выявления любых признаков рецидива.
• Все предметные стекла, на которых делаются мазки кожи, следует предварительно очистить 70% -ным спиртом, ацетоном или спиртом-ацетоном для удаления аморфных частиц. Слайды вытираются насухо чистым полотенцем для рук. Лезвия, которые используются для взятия мазков, очищаются аналогичным образом.
• Слайды следует сушить на воздухе и НИКОГДА не фиксировать нагреванием.
• Их можно отправлять в защитных письмах на номер:

Национальная программа борьбы с болезнями Хансена
Внимание: Клиническая лаборатория — мазки кожи
1770 Врач-Парк Драйв
Батон-Руж, штат Луизиана. 70816
Телефон: (225) 756-3735

Порядок получения мазков

1. При получении мазков с кожи необходимо соблюдать универсальные меры предосторожности.
2. Кожа очищается 70% -ным спиртом и сушится на воздухе или вытирается насухо ватой. (Зефиран делает кожу слишком скользкой и не рекомендуется.)
3. Кожная складка становится относительно бессосудистой путем защемления или легкого пережатия. Если кожа не может быть захвачена защемлением, ее можно сжать. Перчатка хирурга может помочь в захвате.
4. Местная анестезия обычно не требуется. (Если не наблюдается адекватного снижения чувствительности, сделайте местную анестезию с помощью спрея 1% ксилокаина или этилхлорида.) Сдавливание кожи путем защемления помогает при анестезии.
5. Надрез длиной 3-5 мм и глубиной 2-3 мм делается однолезвийным лезвием, очищенным спиртом. Также можно использовать скальпель с лезвием Барда-Паркера №15. Слабое давление для поддержания относительной аваскулярности постоянно прикладывают к области, пока не будет получен адекватный мазок.
6. Небольшое количество крови не мешает чтению, но больших количеств следует избегать, и их обычно можно контролировать с помощью давления щипка. При сильном кровотечении его можно стереть ватным тампоном.
7. После того, как надрез сделан, но до того, как лезвие будет извлечено, внутреннюю поверхность раны соскабливают, удерживая лезвие под прямым углом к ​​разрезу. После соскоба получают тканевую жидкость и кожную ткань.
8. Материал переносится на очищенное предметное стекло микроскопа.Делается мазок средней толщины с видимой однородной непрозрачностью. Мазок наносится круговыми движениями на предметном стекле размером не больше ластика (5-7 мм), , начиная с периферии и заканчивая центром, оставляя центральную «пуговицу» (2-4 мм), которая может быть легко сфокусироваться с микроскопом. Слайды должны быть должным образом помечены, как показано ниже на диаграмме образца для 3 стандартных участков.
9. Пластыря обычно достаточно для защиты места мазка.
10. Один техник снимает все мазки, чтобы обеспечить более однородные и стабильные результаты.
11. Затем мазки отправляются в Национальную программу борьбы с болезнями Хансена для чтения.
12. Диаграмма участков мазков кожи находится по ссылке вверху этой страницы.

Окрашивание мазков кожи

1. Высушите предметное стекло с мазком при комнатной температуре. НЕ НАГРЕВАЙТЕ FIX.
2. Поместите слайды на штатив для окрашивания и залейте 10% формалином на 15 минут для фиксации.
3. Осторожно промойте водой из-под крана. Весь формалин необходимо удалить, чтобы предотвратить образование осадков.
4. Flood Slides с карбол-фуксином Ziehl-Neelsen в течение двадцати минут. Карбол-фуксин необходимо фильтровать перед каждым применением. Фильтрацию можно осуществить, поместив предварительно нарезанные полоски фильтровальной бумаги на предметное стекло перед добавлением красителя и оставив их там на полные двадцать минут.
5. После удаления и удаления полосок фильтровальной бумаги осторожно промойте предметные стекла водопроводной водой, чтобы удалить излишки пятен.
6. Обесцветить 2% спиртом кислоты в течение 1 минуты. Лучше всего это сделать, поместив предметное стекло в пластиковую почтовую коробку с двумя предметными стеклами, наполненную кислотным спиртом.Периодические движения слайда вверх и вниз в кислотном спирте должны удалить весь избыток карбол-фуксина.
7. Осторожно промойте предметные стекла тщательно проточной водой.
8. Контркрашивание щелочным метиленовым синим в течение 30 секунд — 1 минуты.
9. Осторожно промойте водой из-под крана и высушите на воздухе.

ПРИМЕЧАНИЕ. Слайды положительного и отрицательного контроля необходимо использовать каждый день в целях контроля качества.

Z-N Carbol Fuchsin Stain:

Фуксин основной ————————— 1. 0 г.
Кристаллы фенола (плавленые) —————- 5,0 мл.
95% этанол ————————— 10,0 мл.
Вода для приготовления ———————- 100,0 мл.

Растворите пятно в спирте, а затем добавьте смесь фенола и воды. Дайте постоять ночь перед использованием. Хранить в темно-коричневой бутылке. Стабильно 1 год.

Кислый спирт:

Конц. HCl —————————— 2,0 мл.
95% этанол ————————— 98,0 мл.

Щелочной метиленовый синий:

КОН (10%) ————————— 0.10 мл.
Метиленовый синий ———————- 0,35 г.
95% этанол ————————— 30,0 мл.
Вода для приготовления ———————— 100,0 мл.

Растворите пятно в спирте, затем добавьте смесь КОН и воды и оставьте на ночь. Перед использованием профильтровать.

Исследование мазков кожи под микроскопом

Окрашенные мазки исследуют с помощью качественного микроскопа с иммерсионным объективом (x100) для определения общего количества бацилл.Один и тот же человек должен прочитать все мазки на предмет однородности. В мазке будет одинаковое количество бацилл. Тем не менее, четыре отдельных квадранта мазка исследуются и усредняются для определения бактериального индекса.

Отчет об индексе бактерий

Результаты представлены в полулогарифмической шкале от 0 до 6+ с использованием описательной фразы или числового кода. Это показатель общей бактериальной нагрузки пациента. При эффективном лечении он падает примерно на 1 балл в год, так как мертвые бациллы подвергаются лизису и всасываются.

Очень многочисленное	(+6)	более 1000 бацилл на одно иммерсионное поле.
Многочисленные	(+5)	От 100 до 1000 бацилл на поле иммерсии в масле.
Умеренная	(+4)	От 10 до 100 бацилл на поле иммерсии в масле.
Немного	(+3)	От 1 до 10 бацилл на поле иммерсии в масле.
Очень мало	(+2)	От 1 до 10 бацилл на 10 полей.
Редкий	(+1)	От 1 до 10 бацилл на 100 полей.
Не найдено	(НФ)	AFB не видно на всей территории.

Проверено клинической лабораторией 11.06.2008

(PDF) Анализ разделенных образцов клеток, отброшенных из устройств для взятия мазка Папаниколау на жидкой основе

неопределенного значения не имели аномальных клеток на слайдах

TA.Двенадцать из 14 случаев (85,71%) интраэпителиального поражения низкой степени злокачественности

содержали аналогичные клетки на слайдах TA

. В двух из четырех случаев (50%) плоскоклеточного поражения траэпителия in-

высокой степени также были обнаружены аналогичные аномальные клетки на слайдах

TA. Разные результаты включали 1 случай доброкачественных

клеток эндометрия и 4 инфекции Candida, присутствующие на обоих препаратах

, а также 1 случай Trichomonas vaginalis

микроорганизмов, присутствующих только на слайде ThinPrep ™.У 1 образца

мужчин несколько многоядерных гигантских гистиоцитарных клеток были

, присутствующих только на слайде ТА.

Заключение

Образцы, полученные с помощью устройств для сбора ТА, использованных для теста Папаниколау

ThinPrep ™, менее чувствительны, чем первичный образец

для выявления поражений шейки матки. Это соответствует

исследованиям с разделением проб с использованием ThinPrep ™ и обычных

мазков. Наше исследование документально подтвердило наличие

нормальных и аномальных клеток, выброшенных из устройств для отбора проб ThinPrep ™

в большом проценте случаев.Отброшенных

аномальных клеток на предметных стеклах ТА было, однако, немного, когда

по сравнению с первичным образцом, за исключением только 1 из

, связанных с поражением высокой степени. (Acta Cytol 2006; 50: 55–62)

Ключевые слова: мазок Папаниколау, новообразования шейки матки,

исследования образцов, анализ разделенных образцов, одноразовые устройства

.

Во второй половине 20-го века конвенция

мазок Папаниколау шейки матки был единственным наиболее важным тестом

для снижения заболеваемости раком шейки матки на

70% в Соединенных Штатах.Хорошо задокументировано, что

жидких цитологических мазков, приготовленных из обычных устройств для взятия мазков Папаниколау, на

более чувствительны при диагностике поражений шейки матки по сравнению с

по сравнению с обычными препаратами мазков Папаниколау.

Текущее исследование было предпринято, чтобы определить, будут ли одноразовые устройства для отбора проб

, используемые для сбора жидкости —

мазков Папаниколау, также сохранять значительное количество —

клеток, которые могут способствовать окончательной интерпретации —

Цервикальный мазок Папаниколау и / или быть более чувствительным при диагностике поражений шейки матки.

Материалы и методы

Этот проект был одобрен местным наблюдательным советом учреждения

с участием людей. Было проспективно собрано 100 гинекологических мазков Папаниколау

100 пациентов, которые были направлены в клинику плазмы

и другие клиники последующего наблюдения при университете

больниц Северной Каролины, Чапел-Хилл. Первичные

образца (PS) были собраны для ThinPrep ™

Пап-теста (Cytyc Corp., Боксборо, Массачусетс,

США) с помощью пластикового шпателя Pap Perfect ™ и / или устройства для взятия проб

Cytobrush (Medscand Medical AB,

Швеция) и промыть раствором PreservCyt ™ (Cytyc)

в соответствии с протоколом производителя. После переноса клеток

в раствор PreservCyt ™, специальный конец устройств для отбора проб

был отрезан и

помещен в консервирующую жидкость SurePath ™ (рис. 1A).

Клетки, собранные в растворе PreservCyt ™ для первичного скрининга

, были обработаны с помощью процессора слайдов ThinPrep ™ 2000

(Cytyc), окрашены красителем Папаниколау

с использованием стандартных методов и подвергнуты скринингу, интерпретированы и представлены в соответствии с 1990 Bethesda Sys-

Система отчетности для цитологии шейки матки.

Одноразовые устройства для отбора проб, помещенные в консервирующую жидкость

SurePath ™ (TriPath Imaging, Inc.,

Берлингтон, Северная Каролина, США), обрабатывались

процессором слайдов SurePath ™ PREPSTAIN ™

и окрашивали с использованием красителя Colaou указанного производителя Papani-

. Из каждого образца TA

готовили одно слайд в соответствии с протоколом производителя

для обработки гинекологических мазков Папаниколау. Никаких попыток

извлечь ячейки, которые остались на

этих устройствах после обработки SurePath ™, не предпринималось.Слайды ТА

просматривали с помощью стандартного лабораторного микроскопа

(Olympus BH-2, Токио, Япония) и оценивали на

следующие характеристики: (1) количество плоскоклеточных клеток, (2)

наличие или отсутствие эндоцервикальный компонент, (3)

наличие или отсутствие клеток эндометрия, (4) эпителиальные

клеточные аномалии и (5) различные данные

(например, присутствие патогенных организмов).

Плоскоклеточность определялась путем усреднения

количества плоскоклеточных клеток, присутствующих в 10 мощных полях (hpfs) с высокой —

, с использованием линзы объектива 40 × и окуляров 10 ×

.Были проанализированы десять последовательных HPF, начиная с середины мазка. Когда клетки были сконцентрированы на периферии мазка

, подсчет клеток

начинался с края кнопки и продолжался в течение 10

последовательных hpfs по направлению к центру слайда.

Наличие эндоцервикального компонента было определено

как ≥10 хорошо сохранившихся эндоцервикальных столбчатых и / или

плоских метапластических клеток. Если присутствовало <10 клеток, представляющих

эндоцервикального компонента (ЭК), то в образце

ЭК не было.Эпителиальные клетки ab-

нормальных, включая плоскоклеточные и железистые le-

сий, были определены с использованием стандартных критериев из системы

1990 Bethesda для отчетности по цитологии шейки матки.

Результаты для материала SurePath ™ TA были

, а затем по сравнению с первичными слайдами ThinPrep ™

и результатами.

56

Rinas et al.

ACTA CYTOLOGICA Volume 50 Number 1 Январь – февраль 2006 г.

Эпителиальные клетки, выделенные из

устройства для отбора проб ТА, не повлияли на окончательную интерпретацию PS

.

Обработанный отбеливателем мазок для кислотостойкого окрашивания бацилл в Папуа-Новой Гвинее | Лаборатория медицины

Аннотация

Традиционный метод обработки мокроты для микроскопии кислотоустойчивых бацилл был основным инструментом лабораторной диагностики туберкулеза легких в Папуа-Новой Гвинее. При обычном приготовлении необработанная мокрота наносится непосредственно на предметное стекло, не подвергаясь какой-либо стадии обработки. Растущее количество данных свидетельствует о том, что прямой мазок менее чувствителен и в определенной степени ставит под угрозу инфекционный контроль.В литературе рекомендовано несколько альтернативных методов обработки мокроты; однако их расходные материалы труднодоступны и дороги для широкого использования в сельских лабораториях. Концентрация отбеливателя и способ обработки являются наиболее предпочтительным выбором, поскольку отбеливатель недорогой, легкодоступный и обладает бактерицидными свойствами.

Традиционный метод обработки мокроты для микроскопии кислотоустойчивых бацилл (КУБ) был основным инструментом лабораторной диагностики туберкулеза легких в Папуа-Новой Гвинее.В этой процедуре мазок готовится непосредственно из необработанной мокроты, и ему дают высохнуть на воздухе для последующего окрашивания. Однако растущее количество свидетельств ^1–9 предполагает, что выход бацилл в результате такой практики низок; таким образом, этот тест считается менее чувствительным. Напротив, обработанный отбеливателем мазок для окрашивания AFB приобрел популярность, потому что он более чувствителен и безопаснее в использовании. ^10–14 Процесс бактерицидной обработки мокроты с минимальным вмешательством в ее врожденную окрашивающую способность имеет решающее значение для сдерживания лабораторной инфекции туберкулеза. ^1,2,13,15 Поиск и внедрение процедуры, которая преодолевает эти неудачи с наименьшей потребностью в дорогостоящих расходных материалах, является ключевым шагом в улучшении лабораторной диагностики AFB в Папуа-Новой Гвинее. ⁴ Применение бытового отбеливателя (NaOCl) для разжижения мокроты и любой формы метода концентрирования, по-видимому, легко решают эти проблемы.

Основным недостатком прямой микроскопии мазка является то, что количество туберкулезных микобактерий, присутствующих в необработанной мокроте, рассеивается, и последующая микроскопия приводит к более низкому результату.Точно так же, если концентрации бацилл значительно низкие или тонкодисперсные, возможно, что их можно не заметить при микроскопии, особенно в недостаточно укомплектованных и загруженных лабораториях в сельской местности. Присутствие густого непереваренного слизистого фибрина может наложить бациллы, тем самым маскируя видимость во время микроскопии. Более того, загустевшая слизь может мешать обычному окрашиванию, что приводит к плохому качеству окрашивания. В улучшенном способе обработанной отбеливателем мокроте дают постоять в течение ночи, потому что примерно столько же времени требуется для полного разрушения слизистых фибринов с образованием гомогенизированной суспензии. ^7,16 В сельских лабораториях, где отсутствует электричество, можно использовать обработанный отбеливателем осадок для подготовки мазка. Центрифугирование можно проводить в лабораториях, где надежно электричество. Чувствительность микроскопии мокроты при гравитационном осаждении и центрифугировании не сильно различается. ¹⁷ В целом, обе процедуры, по-видимому, эффективно концентрируют частицы, оставляя только осадок для подготовки мазка, тем самым повышая выход бацилл. ^1–4 Тем не менее, в одном исследовании ¹⁷ наблюдался умеренный уровень чувствительности и подчеркивалось использование передовых методов.Однако использование сложного оборудования в большинстве сельских лабораторий Папуа-Новой Гвинеи нецелесообразно.

Важным фактором при непосредственной работе с образцами, содержащими M. tuberculosis , является потенциальный риск перекрестной инфекции. Инфекция, приобретенная в лаборатории, в некоторой степени предсказуема с учетом прямого контакта персонала лаборатории с инфекционными агентами. ^10,18 Поскольку в большинстве лабораторий Папуа-Новой Гвинеи отсутствует защитный шкаф биобезопасности, обработка мокроты отбеливателем считается более безопасным вариантом. ^14,20 Бытовой отбеливатель, состоящий из 3,5% гипохлорита натрия, легко доступен, стоит очень мало ^3,4 и может быть приобретен непосредственно у местного продавца. Таким образом, поставки довольно надежны по сравнению с лабораторными химическими веществами, которые обычно закупаются у удаленных или оффшорных поставщиков. Хитин и N -ацетил-1-цистеин были предложены ^7,16 в качестве лучших альтернатив NaOCl. Однако они не так легко доступны, как бытовой отбеливатель. ^7,16

Как и в случае метода прямого мазка, низкая чувствительность микроскопии КУБ может привести к увеличению числа случаев туберкулеза легких с отрицательным мазком мокроты.Такие случаи были зарегистрированы ^2,19 у лиц с ослабленным иммунитетом, особенно у больных СПИДом и маленьких детей. Множественная лекарственная устойчивость продолжает появляться в наиболее пострадавших провинциях Папуа-Новой Гвинеи; это могло бы увеличиться с учетом низкого социально-экономического статуса наиболее уязвимых слоев населения. ^20–24 В просторечии микроскопия КУБ является основой лабораторной диагностики практически во всех сельских лабораториях мира. Однако данные, которые мы представили здесь, призывают к усовершенствованным методам диагностики, особенно в районах, где отсутствуют шкафы биобезопасности или адекватные условия для культивирования этого организма.Одним из таких методов может быть мазок, обработанный отбеливателем, который следует тщательно проанализировать, оптимизировать и стандартизировать для применения в лабораториях Папуа-Новой Гвинеи и аналогичных областей.

Аббревиатура

Список литературы

1.

и другие. .

Улучшенная микроскопическая диагностика туберкулеза легких в развивающихся странах

.

Транс Р Соц Троп Мед Хиг

.

1995

;

89

(

2

):

191

—

193

.2.

и другие. .

Микробиологическая валидация микроскопии мазка после переваривания мокроты с помощью отбеливателя; на шаг ближе к универсальной диагностике туберкулеза легких

.

Туберкулез

.

2006

;

86

(

1

):

34

—

40

. 3.

.

Повышенная чувствительность прямой микроскопии к кислотоустойчивым микобактериям: седиментация как альтернатива центрифугированию для концентрации туберкулезных микобактерий

.

Дж. Клин Микробиол

.

1996

;

34

(

12

):

3206

—

3207

. 4.

.

Седиментация отбеливателя: возможность оптимизировать микроскопию мазков для диагностики туберкулеза в условиях высокой распространенности ВИЧ

.

Clin Infect Dis

.

2008

;

46

(

11

):

1710

—

1716

. 5.

и другие. .

Связанный с ВИЧ дополнительный выход концентрации отбеливающей мокроты и метод флуоресценции для микроскопического обнаружения туберкулеза

.

Eur J Clin Microbiol Infect Dis

.

2008

;

27

(

9

):

849

—

855

.6.

.

Окружная лабораторная практика в тропических странах, часть 2

.

Кембридж

:

Издательство Кембриджского университета

;

2000

.7.

и другие. .

Методы обработки мокроты для повышения чувствительности микроскопии мазка на туберкулез: систематический обзор

.

Ланцет Infect Dis

.

2006

;

6

(

10

):

664

—

674

.8.

.

Оценка методики концентрационного мазка мокроты для лабораторной диагностики туберкулеза легких

.

Тропическая доктрина

.

2003

;

33

(

3

):

160

—

162

,9.

.

Улучшенная микроскопическая диагностика туберкулеза легких с использованием метода концентрации гипохлорита натрия в Танге, Танзания

.

Tanzan Health Res Bull

.

2007

;

9

(

2

):

87

—

93

. 10.

.

Лабораторные инфекции и биобезопасность

.

Clin Microbiol Ред.

.

1995

;

8

(

3

):

389

—

405

.11.

.

Шкафы биологической безопасности

.

Биомед Инструм Технол

.

2013

;

47

(

4

):

333

—

338

. 12.

.

Создание лаборатории клинической микробиологии [статья на испанском языке]

.

Enferm Infecc Microbiol Clin

.

2010

;

28

(

7

):

453

—

460

. 13.

и другие. .

Повышенная безопасность лаборатории за счет обеззараживания неокрашенных мазков мокроты для кислотостойкой микроскопии

.

Дж. Клин Микробиол

.

2005

;

43

(

8

):

4245

—

4248

. 14.

.

Оптимизация отбеливания микроскопии мазка мокроты при туберкулезе легких

.

Индийский J Tuberc

.

2009

;

56

(

4

):

174

—

184

. 15.

.

Руководство по биобезопасности при обращении с микроорганизмами в учебной лаборатории: разработка и обоснование

.

Дж. Microbiol Biol Educ

.

2013

;

14

(

1

):

78

—

83

.16.

и другие. .

Повышение чувствительности прямой микроскопии для обнаружения кислотоустойчивых бацилл в мокроте: Использование хитина для переваривания слизи

.

Дж. Клин Микробиол

.

2002

;

40

(

2

):

508

—

511

. 17.

.

Повышает ли обработка отбеливателем точность микроскопии мазка мокроты для диагностики туберкулеза легких?

Дж. Клин Микробиол

.

2010

;

48

(

7

):

2433

—

2439

. 18.

.

Лабораторные инфекции

.

Clin Infect Dis

.

2009

;

49

(

1

):

142

—

147

.19.

.

Диагностика туберкулеза легких с отрицательным мазком мокроты у людей с ВИЧ-инфекцией или СПИДом в условиях ограниченных ресурсов: информирование о срочных изменениях политики

.

Ланцет

.

2007

;

369

(

9578

):

2042

—

2049

. 20.

и другие. .

Типы устойчивости туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в Западной провинции Папуа-Новой Гвинеи

.

Int J Tuberc Lung Dis

.

2011

;

15

:

551

—

552

. 21.

.

Туберкулез центральной нервной системы: болезнь из Папуа-Новой Гвинеи в Северном Квинсленде

.

J Детский педиатр

.

2013

;

49

:

E193

—

E198

.22.

и другие. .

Генетическое разнообразие Mycobacterium tuberculosis в Маданге, Папуа-Новая Гвинея

.

Int J Tuberc Lung Dis

.

2012

;

16

(

8

):

1100

—

1107

. 23.

и другие. .

Мутации, вызывающие устойчивость к лекарственным препаратам, у Mycobacterium tuberculosis из Маданга, Папуа-Новая Гвинея

.

BMC Microbiol

.

2012

;

12

:

191

. DOI: .24.

и другие. .

Свидетельства первичной передачи туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в Западной провинции Папуа-Новой Гвинеи

.

Med J Aust

.

2008

;

188

(

3

):

148

—

152

.

© Американское общество клинических патологов

Индийский журнал дерматологии, венерологии и лепрологии

Введение

Буллезный пемфигоид — это аутоиммунное субэпидермальное образование пузырей, характеризующееся отсутствием антител к зоне базальной мембраны (BMZ).Они обнаруживаются как линейная полоса флуоресценции вдоль зоны базальной мембраны C3 в 100%, IgG в 90-95% и реже IgM, IgA при прямой иммунофлуоресценции (DIF). [1] Циркулирующие аутоантитела выявляются примерно в 60-80% случаев при непрямой иммунофлуоресценции (IIF). [1] Недавние исследования показывают, что кожа, которая была рассечена через BMZ с использованием 1 моль / л хлорида натрия для создания искусственного пузыря, является более чувствительным субстратом для этой цели, чем неповрежденная кожа. [2], [3] Настоящее исследование было предпринято с целью оценить эту недавно введенную модификацию и сравнить ее с обычным методом иммунофлуоресценции при буллезном пемфигоиде.

Материалы и методы

Тридцать два случая, которые были клинически и гистологически буллезными пемфигоидами, были включены в исследование. Образцы сыворотки были доступны в 25 случаях. Образцы как для стандартного метода, так и для метода разделения соли были собраны и обработаны следующим образом: [Рисунок — 1]

Прямая иммунофлуоресценция

Биопсию перилезионной кожи с 5-миллиметровым перфоратором собирали в среде Мишеля (транспортная среда) и хранили при комнатной температуре.Образцы биопсии промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) при pH 7,2 в течение 30 минут. Быстрое замораживание со средой для заливки (среда для замораживания тканей Юнга, Leica Instruments, Германия) проводили в криостате при -20 ° C и получали сечение 3-4 микрона. Как минимум 3 среза промывали PBS трижды в течение 10 минут и сушили на воздухе. Использовали каплю специфического регента-флуоресцеинизотиоцианата (FITC), меченного антителами против человеческих IgG, IgM, IgA, комплемента C3 и фибрина. Затем эти слайды инкубировали при 37 °.C в течение 30 минут во влажной камере, а затем снова промывают PBS (3 промывания по 10 минут каждая) для удаления конъюгата. Слайды сушили на воздухе и помещали в буферный глицерин (pH 8). Считывание проводилось под флуоресцентным микроскопом (модель Nikon HB 1010 AF).

Непрямая иммунофлуоресценция:

Образцы сыворотки были доступны в 25 случаях. Перед тестированием их хранили при 4 ° C. Используемый субстрат представлял собой нормальную ткань кожи человека, полученную из отделения пластической хирургии.Кожу переносили в физиологическом растворе, кратко промывали PBS. [Рисунок — 2]

Для стандартного метода ткань помещали непосредственно в среду для заливки, мгновенно замораживали и брали срезы размером 4 микрона. Первоначальные скрининговые разведения сывороток в титрах 1:10 и 1: 100 были сделаны с PBS. Несколько капель разведенных сывороток наливали на меченые предметные стекла и инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут во влажной камере. Вторую инкубацию слайдов с FITC-меткой против человеческого IgG проводили в течение 30 минут.Предметные стекла промывали, сушили на воздухе и помещали в буферный глицерин, а результаты считывали под флуоресцентным микроскопом. Более высокое разведение тестировали, если сыворотка была положительной при соотношении 1: 100. Титр флуоресценции определяли как максимальное разведение сыворотки, дающее видимую флуоресценцию под микроскопом. [Рисунок — 3]

Метод отделения кожи

Для солевого расщепления метод получения образцов ткани, транспортировки и обработки остается одинаковым для образцов DIF и IIF. Образцы тканей, если они хранятся в среде Мишеля, тщательно промывают PBS в течение 30 минут.Инкубировали в 10-15 мл1 моль / л хлорида натрия при 40 ° C в течение 72 часов. Затем эпидермис был отделен от дермы с помощью тонких щипцов, чтобы осторожно его поддеть. Образцы были обработаны таким же образом, как описано выше, для получения срезов размером 4 микрона. Окрашивание DIF и IIF проводили, как указано выше. Флуоресценция была оценена следующим образом:

1+

Только при большом увеличении (40 X)

2+

При просмотре с малым и большим увеличением (20X и 40X)

3+

При просмотре даже на сканере (1 OX) [Рисунок — 4]

Результаты

Прямая иммунофлюоресценция показала 100% положительную реакцию при использовании обоих методов.C3 отдельно или в комбинации был обнаружен в 90-60% случаев рутинным методом. Только отложения IgG наблюдались в 2 случаях. При использовании соли наиболее распространенным рисунком была совмещенная крыша и пол в 50% случаев. Только крыша была отмечена у 40,6%, а пол — у 9,4%. При использовании метода солевого разделения отмечено увеличение интенсивности флуоресценции [Таблица — 1]. Рутинным методом дополнительно отмечен IgG в 7 случаях. При солевом расщеплении DIF сила флуоресценции увеличивалась или оставалась прежней, но никогда не снижалась.Дополнительные отложения иммунореагентов наблюдались в 5 случаях при использовании сплит-техники (15,6%). Это были IgG в 3, IgM в 2 и IgA в одном случае [Таблица — 2].

По ИИФ рутинным методом положительность составила 36%. Этот положительный результат был увеличен до 68% методом солевого расщепления (p <0,05, критерий хи-квадрат). В 2 случаях титры увеличились с 1:80 до 1: 100 и с 1:20 до 1:40. Картина флуоресценции на DIF и IIF с методом солевого разделения оставалась неизменной.

Обсуждение

Метод иммунофлуоресценции с расщеплением соли недавно был описан для оценки субэпидермальных пузырей.[2], [1] Мы провели это исследование, чтобы оценить эту технику в нашей установке для буллезного пемфигоида. Обычная положительность DIF на 100% сохранялась при использовании метода солевого разделения. Этот рисунок аналогичен рисунку, приведенному Beutner et al. [1] При обычном DIF интенсивность флуоресценции увеличивалась, но никогда не снижалась. Максимальная интенсивность была дополнительно отмечена с IgG при тестировании сплит-ткани. Наблюдаемая повышенная интенсивность флуоресценции показана в [Таблица — 1]. Это показывает, что инкубация ткани в солевом растворе не приводит к снижению флуоресценции как по положительности, так и по интенсивности.При использовании метода солевого расщепления в максимальных случаях отмечалась линейная флуоресценция кровли и пола. Рисунок пола отмечен в 3 случаях. Исследования показали, что крыша, крыша и пол часто встречаются в буллезном пемфигоиде. [3], [4] О структуре пола сообщалось редко. [4], [5], [6] Это можно объяснить гетерогенностью буллезного пемфигоидного антигена и стерической модификацией антигена из-за такого лечения, что привело к напольный узор. [7] Это затрудняет дифференциацию буллезного пемфигоида от приобретенного буллезного эпидермолиза (EBA).Однако их можно дифференцировать с помощью электронной микроскопии, иммуноэлектронной микроскопии или ответа на терапию. [7] Одно недавно проведенное исследование описало использование кожи жабы для дифференциации буллезного пемфигоида и EBA при наличии рисунка на полу. [7] В нашем исследовании все 3 пациента с дермальным паттерном флуоресценции были женщинами с легким, средним и тяжелым заболеванием соответственно. Никакой конкретной корреляции, клинической и гистопатологической не обнаружено. Дополнительное отложение иммунореактивного вещества было обнаружено в 5 случаях, включая IgG, IgM, IgA.Никаких ссылок на такой вывод найти не удалось. Мы думаем, что это могло произойти из-за расщепления, в результате чего залежи BMS стали более доступными для обнаружения, что повысило чувствительность теста.

На ИИФ с разлитой солью положительность увеличилась до 68% с 36% при обычном методе. Различные исследования показали повышенную чувствительность кожи с солевым расщеплением в качестве субстрата для IIF [8], [9]. Кроме того, сообщалось о 2 случаях увеличения титра циркулирующих аутоантител при использовании расщепленной кожи в качестве субстрата.[8] Было высказано предположение, что терапия субстратом хлоридом натрия раскрывает или химически модифицирует антигены BMZ, так что они активно реагируют с аутоантителами в сыворотке пациентов. [8] Картина на солевом расщеплении IIF соответствовала таковой, отмеченной на солевом расщеплении DIF. В случае смешанного рисунка флуоресценция была более интенсивной или равной по интенсивности флуоресценции дермы, но никогда не меньше.

Метод солевого расщепления в иммунофлуоресценции — дополнительный инструмент для изучения и дальнейшего выяснения иммунопатологии буллезного пемфигоида.Кожа, расщепленная солью, как субстрат для IIF, демонстрирует более высокую чувствительность при обнаружении циркулирующих антител. Эта процедура дешевая, проста в выполнении и не создает дополнительной нагрузки для лаборатории иммунофлуоресценции, и ее следует использовать в качестве рутинной процедуры иммунофлуоресцентного исследования пациентов с буллезным пемфигоидом.

Диагностический результат и согласие по образцам тонкой иглы из солидных поражений поджелудочной железы: сравнение метода мазка с жидкостной цитологией

Реферат

Предпосылки и цели исследования: Традиционный «метод мазка» для обработки и оценки под контролем эндоскопического УЗИ тонкоигольная аспирация (EUS-FNA) чувствительна к артефактам.Решением проблемы может стать обработка и оценка образцов, собранных в жидкой среде, жидкостная цитология (LBC). Мы сравнили диагностическую ценность мазков EUS-FNA с LBC при солидных поражениях поджелудочной железы в отсутствие быстрой оценки на месте (ROSE).
Пациенты и методы: Последовательные пациенты, которым потребовалась EUS-FNA при солидном поражении поджелудочной железы, были включены в семь больниц в Нидерландах и наблюдались в течение не менее 12 месяцев. Образцы из первого прохода были разделены на два мазка и пробирку для LBC (с использованием ThinPrep и / или Cell block).Мазок и LBC сравнивались с точки зрения диагностической точности на злокачественные новообразования, качества образцов и диагностической согласованности между тремя цитопатологами.
Результаты: Диагностическая точность злокачественных новообразований была выше для LBC (82% (58/71)), чем для мазка (66% (47/71), P = 0,04), но не отличалась при сравнении мазков с ThinPrep ( 71% (30/42), P = 0,56) или клеточный блок (62% (39/63), P = 0,61) индивидуально. Артефакты реже присутствовали в образцах ThinPrep (57% (24/42), P = 0,02) или Cell block (40% (25/63), P <0.001), чем мазки (76% (54/71)). Согласие в отношении злокачественности было одинаково хорошим для мазков и LBC (= 0,71 против = 0,70, P = 0,98), но ниже для ThinPrep (0.2 = 0,26, P = 0,01), чем для мазков.
Заключение: После одного прохода LBC обеспечивает более высокую диагностическую точность, чем традиционный метод мазка мазка для EUS-FNA солидных поражений поджелудочной железы в отсутствие РОЗЫ. Следовательно, LBC может быть альтернативой традиционному методу мазка, особенно в центрах, где отсутствует РОЗА.

Публикация

Endoscopy International Open , 2020, 08 (02), E155 — E162

Какое влияние оказывают перемешивание, время хранения и температура хранения на количество яиц в образцах стула?

Аннотация

Фон

Гельминты, передающиеся через почву, поражают примерно пятую часть населения мира и отрицательно сказываются на здоровье.Метод Като-Каца — рекомендуемый метод для обнаружения яиц гельминтов, передающихся через почву, в образцах стула, особенно в программных условиях. Однако некоторые вопросы по его порядку остаются. Наше исследование было направлено на изучение влияния времени хранения, температуры хранения и перемешивания образцов стула на количество фекальных яиц (FEC).

Методология / основные выводы

В рамках клинических испытаний на острове Пемба, Объединенная Республика Танзания, у школьников было взято 488 образцов стула.Эти образцы оценивали в трех экспериментах. В первом эксперименте (n = 92) два предметных стекла Като-Кац были приготовлены из одного и того же образца стула, одно хранилось при комнатной температуре, другое в холодильнике в течение 50 часов, и каждое предметное стекло было проанализировано в девяти временных точках (20 , 50, 80, 110, 140 минут, 18, 26, 42 и 50 часов). Во втором эксперименте (n = 340) цельные образцы стула были разделены на две части, одна часть хранилась при комнатной температуре, а другая часть была помещена в холодильник на 48 часов.Из каждой части был подготовлен один слайд Като-Каца и проанализирован в трех временных точках в течение двух дней (0, 24 и 48 часов). В третьем эксперименте (n = 56) образцы цельного стула перемешивали в течение 15 секунд шесть раз, и в каждый момент времени готовили и анализировали предметное стекло Като-Каца.

Средние значения FEC анкилостомы предметных стекол Като-Каца, хранящихся при комнатной температуре, неуклонно снижались после подготовки предметных стекол. Через два часа среднее значение FEC анкилостомы снизилось с 22 до 16, тогда как никакого снижения не наблюдалось, если предметные стекла Като-Каца хранились в холодильнике (19 против 21).Эффект взаимодействия время x накопление был статистически значимым (коэффициент 0,26, 95% ДИ: от 0,17 до 0,35, p <0,0001). Через 24 часа среднее значение FEC анкилостомы упало почти до нуля, независимо от условий хранения. Образцы цельного стула, хранящиеся при комнатной температуре в течение одного дня, приводили к снижению FEC анкилостомы на 23% (p <0,0001) по сравнению с уменьшением на 13% (p <0,0001), если образцы хранились в холодильнике. Количество фекальных яиц А . люмбрикоид e s и T . trichiura оставался стабильным с течением времени независимо от температуры хранения образцов цельного стула. Наконец, мы обнаружили значительное снижение вариабельности анкилостомы и Т и . trichiura яиц с увеличивающимися циклами перемешивания образца, но не для A . люмбрикоид . Для анкилостомы мы наблюдали одновременное снижение средних значений FEC, что затрудняло составление рекомендаций по перемешиванию образцов.

Выводы / Значение

Наши результаты показывают, что образцы стула (i) следует анализировать в день сбора и (ii) следует анализировать через 20–30 минут после подготовки слайдов; если это невозможно, слайды Като-Кац можно хранить в холодильнике не более 110 минут.

Информация об авторе

Кишечные черви, такие как анкилостомы, Ascaris lumbricoides и Trichuris trichiura , заражают каждого пятого человека в мире. У детей они могут вызвать когнитивные и физические нарушения. Точное обнаружение этих инфекций важно для лечения пациентов и контроля распространения кишечных глистов. В настоящее время метод Като-Каца является наиболее часто используемым методом диагностики, особенно в программных настройках. Однако остается еще несколько нерешенных вопросов.В этом исследовании мы стремились изучить влияние времени хранения, температуры хранения и перемешивания образцов стула на количество яиц глистов, обнаруживаемых методом Като-Каца. Мы включили 488 образцов стула, взятых у школьников на острове Пемба, Объединенная Республика Танзания. Мы обнаружили, что при комнатной температуре яйца анкилостомы быстро исчезают со слайдов Като-Каца, но при хранении в холодильнике яйца сохраняются до 110 минут. Для A . lumbricoides и T . trichiura не было обнаружено соответствующей тенденции в подсчете фекальных яиц на предметных стеклах Като-Каца с течением времени и / или влияния температуры хранения. Однако хранение целых образцов стула в холодильнике на ночь не предотвратило исчезновения яиц анкилостомы, поэтому мы рекомендуем анализировать все образцы в день сбора. Для A . люмбрикоид e s и T . trichiura количество яиц в фекалиях оставалось стабильным в образцах цельного стула с течением времени, независимо от температуры хранения.Наконец, мы обнаружили, что перемешивание образцов снижает разброс количества яиц в фекалиях на анкилостомы и T . trichiura , но не для A . люмбрикоид . Количество фекальных яиц анкилостомы уменьшалось с увеличением количества циклов перемешивания образца.

Образец цитирования: Bosch F, Palmeirim MS, Ali SM, Ame SM, Hattendorf J, Keizer J (2021) Диагностика гельминтов, передающихся через почву, с использованием метода Като-Каца: как влияет перемешивание, время хранения и температура хранения в образце стула количество яиц? PLoS Negl Trop Dis 15 (1): e0009032.https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032

Редактор: Cinzia Cantacessi, Кембриджский университет, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

Поступило: 2 сентября 2020 г .; Дата принятия: 3 декабря 2020 г .; Опубликован: 22 января 2021 г.

Авторские права: © 2021 Bosch et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование финансировалось Швейцарским национальным научным фондом (номер 320030_175585) компании JK. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

В глобальном масштабе гельминтами, передаваемыми через почву (ППГ), заражается около 1 человека.5 млрд человек и широко распространены в тропических и субтропических регионах [1]. Влажная почва, неадекватная санитария и личная гигиена, ограниченный доступ к чистой воде, тесные условия жизни, отсутствие ношения обуви, отсутствие доступа к медицинскому обслуживанию и санитарному просвещению являются факторами, способствующими передаче этих паразитов [1–4]. Наиболее распространенными СТГ являются Ascaris lumbricoides , Trichuris trichiura и анкилостомоза ( Necator americanus , Ancylostoma duodenale и Ancylostoma ceylanicum ).По оценкам, 819 миллионов человек во всем мире инфицированы вирусом A . lumbricoides , 465 миллионов с T . trichiura, и 489 млн с анкилостомозом [5]. Гельминтоз, передаваемый через почву, вызывает значительную заболеваемость, составив в 2017 г. 1,9 миллиона лет жизни с поправкой на инвалидность [6]. Последствия этих инфекций включают потерю крови, железодефицитную анемию и нарушение усвоения, пищеварения и всасывания питательных веществ. Это может привести к нарушению когнитивного и физического развития у детей [1,4,7].

Правильная диагностика этих инфекций является ключом к борьбе с ними. Техника Като-Каца является наиболее распространенным методом диагностики инфекций, вызываемых ППГ [8–11]. Этот метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) из-за его простоты и относительно невысокой стоимости, так как большая часть оборудования многоразового использования. Метод Като-Каца показывает хорошие результаты, особенно при обнаружении гельминтозов средней и высокой интенсивности, и, по-видимому, столь же чувствителен, как и новые диагностические методы на основе микроскопа, такие как McMaster, Mini-FLOTAC и FECPAK ^G2 , или молекулярные методы, такие как КПЦР [2,9,12–17].Однако у этого метода есть один серьезный недостаток: его чувствительность к легким инфекциям довольно низкая [9,10,13,14,18–21]. Обнаружение яиц может быть особенно трудным в случае анкилостомы по нескольким причинам. Яйца анкилостомы с тонкой оболочкой вылупляются в почве вскоре после выделения и менее устойчивы, чем яйца A . lumbricoides и T . trichiura , которые вылупляются только после прохождения через желудок [22]. В нескольких исследованиях сообщается, что время между сбором образца стула и лабораторной обработкой значительно снижает количество фекальных яиц анкилостомы (FEC) [18,20,22,23].Когда большое количество образцов собирается и доставляется в лабораторию, они могут храниться на ночь и анализироваться на следующий день из-за ограничений по времени.

Второй фактор, который может повлиять на чувствительность Като-Каца, связан с вариациями выхода яиц гельминтов между образцами и внутри образца, i . и . скопление яиц в разных частях образца стула [10,20,23–29]. Чтобы преодолеть различия в выделении яиц внутри образца и изо дня в день, рекомендуется анализировать несколько толстых мазков Като-Каца из одного и нескольких образцов стула, собранных в течение последовательных дней [10,11,18,20,30].Кроме того, рекомендуется гомогенизировать весь образец стула путем его тщательного перемешивания перед приготовлением толстого мазка Като-Каца для контроля вариаций внутри образца [18,22,31], поскольку яйца ГПГ могут быть распределены неоднородно [20,23, 24,26,27,29]. Более того, только очень небольшое количество стула (41,7 мг) используется для каждого толстого мазка Като-Каца, что еще более повышает вероятность пропуска инфекции ППГ световой интенсивности, если яйца распределены в образце неравномерно [18,21]. Однако исследования не обнаружили уменьшения количества анкилостомы, A . lumbricoides и T . trichiura дисперсия FEC внутри образца после перемешивания образца стула [23,24]. Важно отметить, что во всех этих исследованиях использовались небольшие выборки — от двух до девяти отдельных образцов стула.

Третьей причиной, по которой чувствительность Като-Каца к анкилостомы ниже, чем к другим паразитам, может быть промежуток времени между подготовкой и чтением слайдов. Несколько исследований обнаружили [28] или выдвинули гипотезу [2,9,26], что задержка значительно снижает чувствительность и FEC для анкилостомы.Глицерин, используемый в методе Като-Каца, со временем разрушает яйца анкилостомы, что приводит к быстрой очистке яиц и делает их невидимыми для устройства считывания слайдов [21]. Поэтому ВОЗ рекомендует проводить микроскопический анализ толстых мазков Като-Каца в течение 30–60 минут после подготовки слайдов [17]. В отличие от яиц анкилостомы Т . trichiura и A . lumbricoides яйцо видно в течение нескольких месяцев [17]. Однако неясно, сколько времени яйца анкилостомы остаются видимыми на слайде Като-Каца и могут ли на это повлиять различные условия хранения.Насколько нам известно, исследований, измеряющих влияние различных условий хранения в ночное время на STH FEC, не проводилось. Более того, до сих пор нет рекомендаций о том, как долго следует перемешивать образец стула для достижения хорошей гомогенизации яиц СТГ.

Таким образом, крайне важно продолжить изучение того, как оптимизировать и повысить чувствительность метода Като-Каца, поскольку в противном случае можно систематически недооценивать распространенность инфекций и, в контексте клинических испытаний, показатели излечения, показатели сокращения яиц. а эффективность препарата можно переоценить.Наше исследование преследовало две основные цели: (i) количественно оценить влияние времени хранения и температуры хранения на FEC отдельных слайдов Като-Каца и целых образцов стула, и (ii) количественно оценить влияние гомогенизированных образцов стула на вариации. ТИК.

Методы

Заявление об этике

Это исследование было включено в рандомизированное открытое клиническое исследование в школах, которое проводилось с июля по сентябрь 2019 г. в четырех школах на острове Пемба, Объединенная Республика Танзания.Основная цель клинического исследования заключалась в оценке безопасности и эффективности новой жевательной формы мебендазола по сравнению со стандартной таблеткой мебендазола для проглатывания у детей в возрасте от 3 до 12 лет. Методология и результаты этого клинического испытания (зарегистрированного на сайте ClinicalTrials.gov под номером NCT03995680) опубликованы в другом месте [32].

Область исследования и полевые процедуры

Для этого исследования использовалась часть образцов стула, собранных для клинического исследования.В школе участники получили пустой контейнер для стула, который их попросили вернуть на следующее утро с образцом стула. Образцы собирали в школах, хранили в ящиках, охлаждаемых пакетами со льдом, и перевозили на машине в центральную лабораторию в Чаке-Чаке, Пемба (Лаборатория общественного здравоохранения Иво де Карнери).

Лабораторные процедуры

Чтобы оценить влияние времени и температуры хранения на FEC паразитов, мы провели два эксперимента: первый с использованием предметных стекол Като-Каца, а второй — с использованием целых образцов стула перед приготовлением предметных стекол.Третий эксперимент направлен на оценку влияния перемешивания образцов стула на FEC. Для всех экспериментов мы выбрали образцы от детей, которые, как мы уже знали, были инфицированы хотя бы одним STH (анкилостомоз, A . lumbricoides и T . trichiura ).

Эксперимент с хранением Като-Каца.

Образцы стула, отобранные для этого эксперимента, перемешивали деревянной лопаточкой в ​​течение одной минуты для гомогенизации. Из каждого образца были приготовлены два толстых мазка Като-Каца с использованием стандарта 41.Шаблоны 7 мг. Одно из слайдов сразу хранили в холодильнике (~ 5 ° C), а другое — при комнатной температуре (~ 25 ° C). Двадцать минут спустя оба предметных стекла Като-Каца впервые подверглись микроскопическому анализу. Опытные лаборанты подсчитали и зарегистрировали анкилостомоз, А . lumbricoides и T . тричиура яйцо. Затем эти же слайды были возвращены в исходные условия хранения: комнатная температура или холодильник.Слайды были перечитаны через 50, 80, 110 и 140 минут, а также утром и вечером в следующие два дня в 18, 26, 42, 50 часов. Эти слайды всегда хранились либо при комнатной температуре, либо в холодильнике между каждым моментом считывания (рис. 1).

Эксперимент с хранением всего образца.

Образцы стула, отобранные для этого эксперимента, гомогенизировали в течение одной минуты. Препарат Като-Каца готовили из каждого из этих образцов и анализировали под световым микроскопом на анкилостомоз, A . lumbricoides и T . trichiura яиц между 30 и 60 минутами после подготовки предметного стекла [17]. Затем каждый образец стула был разделен на два пластиковых контейнера с одинаковым идентификационным номером. Один контейнер хранился в холодильнике при температуре около 5 ° C. Другой контейнер хранился при комнатной температуре около 25 ° C. На следующий день, примерно через 24 часа, из каждого из этих образцов стула был приготовлен один толстый мазок Като-Каца и проанализирован, как описано выше.Тот же процесс повторяли через 48 часов. Подсчет всех СТГ в фекальных яйцах через 0, 24 и 48 часов из образцов, хранящихся при комнатной температуре и в холодильнике, регистрировали лаборанты, анализирующие слайды Като-Каца (рис. 2).

Эксперимент по гомогенизации.

Образцы стула, отобранные для этого эксперимента, не сразу гомогенизировали. Кусочки стула, использованные в этом эксперименте, были взяты из неуказанных областей образцов стула, как это обычно делается при рутинном анализе.Сначала из каждого образца готовили толстый мазок Като-Каца и анализировали под световым микроскопом на анкилостомоз, A . lumbricoides и T . trichiura яиц между 30 и 60 минутами после подготовки предметного стекла [17]. Затем каждый образец стула полностью перемешивали деревянным шпателем в течение 15 секунд. Опять же, кусок стула был удален и использован для приготовления толстого мазка Като-Каца. Этот процесс перемешивания и получения толстых мазков Като-Каца проводился шесть раз для каждого целого образца стула.В результате было получено семь слайдов Като-Каца для каждого целого образца стула с FEC, определенными после 0, 15, 30, 45, 60, 75 и 90 секунд гомогенизации. Каждый раз использовался новый деревянный шпатель. Все толстые мазки Като-Каца были проанализированы под микроскопом на анкилостомоз, A . lumbricoides и T . trichiura между 30 и 60 минутами после приготовления (рис. 3).

Статистический анализ

Образцы стула, содержащие менее двух яиц в первом толстом мазке Като-Каца, не были включены в исследование.В соответствии с рекомендациями ВОЗ [33] инфекции классифицировались на легкие, средние и тяжелые.

Эксперимент с запоминанием Като-Каца был проанализирован с использованием моделей смешанного эффекта с гауссовыми членами ошибки и случайным субъектным эффектом для учета повторных измерений. Мы смоделировали логарифм FEC +1 как приблизительно нормальный, что привело к существенно лучшему соответствию модели по сравнению с пуассоновскими или отрицательными биномиальными моделями. Время было включено как непрерывная переменная, и поэтому мы включили только равноотстоящие временные интервалы в анализ эксперимента с запоминанием Като-Каца, и . и . наблюдения продолжались до 140 минут, все с интервалом в 20 минут. Помимо типа хранилища и времени, в эксперимент с хранением Като-Каца было включено взаимодействие хранилища и времени. Эксперимент с хранением всего образца был проанализирован с помощью парного t-критерия с использованием логарифмически преобразованных FEC в качестве результата. Доверительные интервалы (ДИ) для относительных изменений медианы и средних значений были оценены с использованием методов повторной выборки начальной загрузки с 5000 повторениями. Для эксперимента по гомогенизации наш основной интерес состоял в том, чтобы оценить, уменьшается ли вариация FEC с увеличением времени перемешивания.Изменение вариабельности оценивали с помощью двухэтапного анализа. Во-первых, мы рассчитали относительную разницу каждого наблюдения от общего среднего FEC на образец стула. Поскольку легкие инфекции особенно подвержены относительным изменениям, в анализ были включены только образцы с FEC, равным пяти или более в первый момент времени. После этого мы применили модель линейной регрессии со случайным эффектом, указав время перемешивания в качестве предиктора для оценки остатков. Наконец, мы использовали абсолютные значения остатков в качестве результата и снова подобрали модель регрессии со случайным эффектом, чтобы количественно оценить изменение вариации.Этот подход имеет то преимущество, что он учитывает возможные изменения средних значений FEC с увеличением времени перемешивания. Все анализы проводились с использованием статистической программной среды R версии 3.5.1.

Результаты

Размер выборки и интенсивность заражения

Всего 92 образца были использованы в эксперименте по хранению Като-Каца, 340 — во всем эксперименте по хранению образцов и 56 — в эксперименте по гомогенизации. Число анкилостомы, А . lumbricoides и T . trichiura инфекций и соответствующие интенсивности инфекции, наблюдаемые в каждом эксперименте, сведены в Таблицу 1.

Эксперимент по хранению Като-Каца

Хранение слайдов Като-Кац при комнатной температуре (n = 67) привело к устойчивому снижению среднего FEC анкилостомы с 21,7 до 13,1 между 20 и 140 минутами (таблица 2). Кроме того, медиана FEC снизилась с 12,0 до 10,5 через 50 минут (относительное изменение медианы -12,5%, 95% ДИ: от -0,27 до 0,22), 8,5 через 80 минут (-29.2%, 95% ДИ: от -0,40 до 0,00) и 6 через 110 минут (-50%, 95% ДИ: от -0,60 до -0,12). На классификацию образцов как положительных или отрицательных, легких или умеренных / тяжелых также повлияло время между подготовкой слайда и считыванием. Через 50 минут 4% образцов, хранимых при комнатной температуре, перестали быть положительными для анкилостомов на отрицательные. Напротив, при хранении слайдов в холодильнике (n = 62) не наблюдалось заметного снижения средних значений FEC анкилостомы за тот же период времени (19.4 против 19,7). Тест на взаимодействие хранение × время показал, что снижение FEC с течением времени было значительно выше в образцах, хранящихся при комнатной температуре, по сравнению с образцами, хранящимися в холодильнике (коэффициент _{log количества яиц} : 0,26, 95% ДИ: 0,17-0,35, p <0,0001; таблица S1). Через 18 часов, независимо от условий хранения, FEC упала практически до нуля (Таблица 2 и Рис. 4A).

Рис. 4. Эксперимент по хранению Като-Каца: Абсолютное медианное количество яиц в кале (FEC) изменяется со временем для (A) анкилостомы (n = 67 для комнатной температуры, n = 62 для холодильника), (B) A . lumbricoides (n = 38) и (C) T . трихиура (n = 85).

Синий = температура холодильника, красный = комнатная температура, A . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.g004

Таблица 2. Эксперимент с хранением Като-Каца: результаты для анкилостомы, Ascaris lumbricoides и Trichuris trichiura .

FECs = количество фекальных яиц, A . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura , min = минуты, h = часы.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.t002

Для A . lumbricoides не наблюдалось последовательной тенденции с течением времени в средних значениях FEC слайдов, хранящихся при комнатной температуре (n = 38) или в холодильнике (n = 38) (таблица 2 и рис 4B).Взаимодействие накопление × время было статистически значимым, но размер эффекта был довольно небольшим (коэффициент _{логарифмических подсчетов яиц} : 0,03, 95% ДИ: от 0,00 до 0,06, p = 0,04; таблица S1).

В случае T . trichiura , средние значения FEC для обоих типов хранения (n = 85) оставались в основном стабильными, но увеличивались через 26 часов (таблица 2 и рис. 4C). Взаимодействие хранение × время показало, что у слайдов, хранящихся в холодильнике, со временем наблюдалось значительно меньшее снижение FEC, чем у слайдов при комнатной температуре (коэффициент _{log количества яиц} = 0.17, 95% ДИ: от 0,12 до 0,23, р <0,0001; Таблица S1). Примечательно, хотя коэффициент для Т . trichiura (0,17) ниже, чем у анкилостомы (0,26), относительный эффект менее выражен для T . trichiura , потому что средние значения FEC в два раза выше (таблица 2). Для всех трех паразитов, если предметные стекла хранились в холодильнике, FEC увеличивалась с 20 до 50 минут (таблица 2 и рисунок 4).

Эксперимент по хранению всего образца

Хранение образцов стула анкилостомы в холодильнике привело к более низкому изменению FEC по сравнению с хранением их при комнатной температуре.Для образцов анкилостомы (n = 259), хранящихся при комнатной температуре, средние значения FEC снизились на 23% с 19,2 на исходном уровне до 14,8 через 24 часа (95% ДИ: от 0,12 до 0,33, p <0,0001) по сравнению со снижением на 13% ( среднее значение FEC через 24 часа: 16,7; 95% доверительный интервал: от -0,01 до 0,24, p <0,0001) для образцов, хранящихся в холодильнике (таблица 3 и рисунок 5A). Среднее изменение FEC среди условий хранения было статистически значимым (средняя разница через 24 часа: 1,9 FEC, p <0,0001). Аналогичная картина наблюдалась через 48 часов (разница: 2.1 FEC, p <0,0001; Таблица S2). На классификацию образцов анкилостомы как положительных или отрицательных, легких или умеренных / тяжелых повлияло хранение образцов в течение ночи. При хранении при комнатной температуре 17% образцов анкилостомы изменились с положительных на отрицательные с 0 дня до 1 дня, тогда как только 13% образцов, хранящихся в холодильнике, претерпели это изменение. Однако образцы с положительным результатом на анкилостомы, хранящиеся в холодильнике, не менее склонны к изменению от категории умеренных / тяжелых к легким с 0 дня на 1 или с 0 на 2 день по сравнению с образцами, хранящимися при комнатной температуре.

Рис. 5.

Эксперимент по хранению всего образца: Относительное количество фекальных яиц (FEC) изменяется со временем для (A) анкилостомы (n = 259), (C) Ascaris lumbricoides (n = 163), (E) Trichuris trichiura (n = 313) и абсолютные числа FEC и относительное изменение FEC между днем ​​0 и днем ​​1 для анкилостомы (B), Ascaris lumbricoides (D) и Trichuris trichiura (F). Для A, C и E: пунктирная линия = медиана. Для B, D и F: линия = среднее значение. Синий = температура холодильника, красный = комнатная температура, A . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.g005

Таблица 3. Эксперимент с хранением всей выборки: средние значения FEC в день 0, день 1 и день 2 для анкилостомы, A . lumbricoides и T . тричиура .

Относительное изменение = относительное изменение, FEC = количество фекальных яиц, A . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.t003

Модель A . lumbricoides образец (n = 163), хранящийся при комнатной температуре, показал незначительное снижение FEC на 9% с 754 на исходном уровне до 688 через 24 часа по сравнению с незначительным снижением на 7% (среднее значение FEC через 24 часа). : 698) в образцах, хранящихся в холодильнике (Таблица 3).Хотя разница между двумя условиями хранения была статистически значимой, она была незначительной (средняя разница через 24 часа: 10,9 FEC, p = 0,01; средняя разница через 48 часов: 6,9 FEC, p = 0,05; таблица S2).

В случае T . trichiura среднее значение FEC в образцах (n = 313), хранящихся при комнатной температуре, значительно увеличилось с дня 0 до дня 1 (на 18% с 49,6 на исходном уровне до 58,5 через 24 часа, p <0,0001) и с дня 0 до дня 2 ( на 20%, среднее значение FEC через 48 часов: 59.7, р <0,0001). Аналогичные результаты наблюдались для образцов, хранящихся в холодильнике (таблица 3 и рис. 5E). Среднее изменение FEC между образцами, хранящимися при комнатной температуре и температуре холодильника, было статистически значимым, но оно было очень незначительным - около 4% (средняя разница через 24 часа: 2,59 FEC, p <0,0001; средняя разница через 48 часов: 2,23 FEC, p < 0,0001; Таблица S2).

Относительное изменение FEC от одного дня к другому, по-видимому, зависит от интенсивности заражения.В случае анкилостомоза и . lumbricoides , более высокая интенсивность инфекции приводит к более высокому среднему относительному изменению FEC независимо от условий хранения (рис. 5B и 5D). То же самое было обнаружено для Т . trichiura но, помимо этого, легкий T . Инфекции trichiura привели к повышению FEC на следующий день (рис. 5F).

Эксперимент по гомогенизации

При увеличении числа циклов перемешивания средние значения FEC уменьшались в образцах с яйцами анкилостомы (n = 28; рис. 6A и таблица 4).Для A . lumbricoides (n = 19) мы наблюдали небольшое увеличение средних значений FEC через каждые 15 секунд дополнительного перемешивания, тогда как FEC в T . trichiura образцов (n = 52) оставались неизменными (рис. 6B и 6C и таблица 4). Статистический анализ остатков показал статистически значимое снижение вариации FEC для образцов анкилостомы (изменение остатков за 15 секунд: -0,02, 95% ДИ: от -0,03 до -0,007, p = 0,004) и T . trichiura сэмплов (изменение за 15 сек: -0.01, 95% ДИ: от -0,02 до -0,002, p = 0,01), но не для A . lumbricoides образец (изменение за 15 секунд: -0,001, 95% ДИ: от -0,007 до 0,005, p = 0,66). Графическая проверка коробчатых диаграмм показала, что для T . trichiura перемешивание образцов оказало, в первом случае, влияние на количество экстремальных значений, но ширина межквартильного диапазона была меньше затронута (рис. 6С).

Рис. 6.

Эксперимент по гомогенизации: Относительное количество фекальных яиц (FEC) отличается от общего среднего значения на образец (более 7 наблюдений) после различной продолжительности гомогенизации для (A) анкилостомы (n = 28), (B) A . lumbricoides (n = 19) и (C) T . трихиура (n = 52). На рисунках показаны прямоугольные диаграммы и наблюдаемые значения (с колебаниями). А . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.g006

Таблица 4. Эксперимент по гомогенизации: среднее количество фекальных яиц (FEC), средние относительные отличия от общего среднего FEC на образец (более 7 наблюдений), стандартный отклонение относительных различий и средних значений остатков, оцененных по модели регрессии случайных эффектов.

А . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.t004

Обсуждение

Метод Като-Каца в настоящее время является опорой для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и рекомендован ВОЗ из-за простоты и экономической эффективности [2,9–11,17]. Однако, хотя он очень чувствителен при обнаружении умеренной и тяжелой интенсивности заражения, его чувствительность к легким инфекциям довольно низка, особенно для анкилостомы, поскольку яйца анкилостомы довольно нестабильны [2,22].Хотя метод Като-Каца использовался в течение нескольких десятилетий, влияние таких факторов, как время хранения, температура хранения и перемешивание образцов стула, глубоко не изучалось.

Как долго можно хранить слайды Като-Каца при разных температурах перед анализом?

Во избежание удаления яиц анкилостомы ВОЗ рекомендует прочитать толстый мазок Като-Каца через 30–60 минут после подготовки слайда [17]. Хотя влияние времени между подготовкой слайдов и считыванием их на FEC-анкилостоме изучалось [28] или обсуждалось [2,9,26] в нескольких исследованиях, период времени, в течение которого FEC-анкилостомы остаются видимыми на слайдах Като-Каца и никогда не изучалось, сохранят ли их дольше в холодильнике.Мы обнаружили, что для анкилостомы FECs начали снижаться через 20 минут после подготовки слайда. В нашем исследовании при хранении при комнатной температуре рекомендация ВОЗ читать слайды до 60 минут привела к удалению около 10% яиц анкилостомы перед чтением. Эксперимент также показал, что хранение слайдов Като-Кац в холодильнике положительно сказалось на сохранении яиц анкилостомы до 110 минут, поэтому температура хранения может играть важную роль. Наши результаты согласуются с исследованием 1960-х годов; авторы подвергли предметные стекла температуре 24, 30 и 36 ° C и обнаружили, что яйца анкилостомы исчезают быстрее с повышением температуры [28].

В отличие от анкилостомы, T . trichiura FEC увеличились через 26 часов. Этот неожиданный результат мог иметь разные объяснения. Первый может быть связан с окрашиванием яиц; возможно, чем дольше вы ждете, тем заметнее T . трихиура становится яиц. Второе объяснение состоит в том, что естественные вариации в подсчете яиц или вариабельность считывателя могли повлиять на результаты, поскольку слайды не назначались случайным образом лаборантам, и они не были слепыми.Дальнейшие исследования должны изучить эти два вопроса более подробно. Для A . lumbricoides , хранение толстых мазков Като-Каца до 50 часов не влияло на FEC слайдов Като-Каца. Кроме того, для A . lumbricoides и T . trichiura , разница между условиями хранения была незначительной. Таким образом, в условиях наличия электричества и наличия холодильников мы рекомендуем хранить слайды Като-Каца в холодильнике, чтобы избежать недооценки FEC.

Интересно, что у слайдов, хранящихся в холодильнике, было небольшое увеличение FEC через 50 минут для всех трех паразитов. Мы предполагаем, что хранение слайдов Като-Кац в холодильнике сразу после приготовления замедлило процесс окрашивания яиц СТГ. Следовательно, после 20 минут хранения в холодильнике некоторые яйца все еще были невидимы для лаборантов и, следовательно, не регистрировались. Поэтому важно избегать помещения слайдов в холодильник сразу после приготовления слайдов.Вместо этого это следует сделать только через 20 минут.

Наши результаты показали, что, когда слайды хранятся при комнатной температуре (около 25 ° C), FEC анкилостомы распадаются еще быстрее, медиана FEC снижается на 30% через 80 минут после подготовки слайда. Наши результаты могут способствовать разработке адаптированной техники Като-Каца для более длительного сохранения яиц анкилостомы.

Каково влияние времени хранения и температуры хранения на FEC образца стула?

Яйца анкилостомы быстро исчезают в образцах стула [18,22,23].Мы тщательно исследовали влияние времени хранения и температуры хранения на FEC в образцах цельного стула. Наши результаты показывают, что при комнатной температуре наблюдается значительное снижение FEC анкилостомозов со дня сбора до следующего дня, а также со дня сбора до второго дня. Хотя уменьшение FEC также наблюдалось, когда образцы хранились в холодильнике, уменьшение было только половиной размера. Никаких заметных различий между одним или двумя днями хранения образцов не наблюдалось.Krauth и др. . обнаружили значительное снижение FEC в образцах, когда они хранились в течение 8 часов при комнатной температуре, но этого не наблюдалось при хранении на льду или покрытии влажной тканью [23]. Этот противоречивый результат может быть связан с разными временными точками обследования, поскольку наша первая оценка была проведена позже, через 24 часа после сбора образцов. Важно отметить, что в случае анкилостомы, если образцы стула не анализируются в один и тот же день, хранение образцов с одного дня на следующий, независимо от условий хранения, может повлиять на классификацию образцов как легких. или умеренная / высокая интенсивность, и даже как положительная или отрицательная.По мере увеличения времени хранения мы наблюдали небольшое уменьшение FEC для A . lumbricoides выборок, тогда как, что удивительно, медиана FEC составила T . trichiura даже увеличивалась с дня 0 до дня 1 и с дня 0 до дня 2 для обоих условий хранения. Это может быть связано с естественными вариациями в подсчете яиц, с вариабельностью читателей или с тем фактом, что читатели не считали яйца так тщательно в течение двух последующих дней, особенно при высокой интенсивности заражения, поскольку подсчет всех яиц трудоемкий и трудоемкий процесс. кропотливый.

Краут и его коллеги не обнаружили влияния времени или температуры на T . trichiura FEC в течение первых 8 часов после сбора образца. Они не представляют результатов для A . lumbricoides из-за небольшого размера выборки. Интересно, что мы заметили, что для обоих паразитов FEC образцов, хранящихся в холодильнике, были значительно выше, чем образцы, хранящиеся при комнатной температуре. Это могло быть либо случайно, либо, возможно, A . lumbricoides и T . Яйца трихиуры более стабильны или видны при хранении в холодильнике.

Изменяет ли гомогенизация образцов стула вариацию FEC?

Некоторые авторы рекомендуют гомогенизировать образцы стула путем их перемешивания перед приготовлением слайдов Като-Каца [18,22,31]. Хотя это специально не упоминается в лабораторных инструментах ВОЗ для диагностики кишечных паразитов, гомогенизация образцов кала часто выполняется в исследованиях, работающих с ГПГ [34].В нашем текущем исследовании мы стремились определить, влияет ли этот шаг на изменение FEC и как долго нужно перемешивать образец. Мы нашли разные результаты для разных видов. Гомогенизация образцов перед приготовлением предметных стекол значительно снизила разброс значений FEC для анкилостомы и T . тричиура проб. Для T . trichiura проб, перемешивание оказало влияние, особенно на частоту экстремальных явлений, и . и .FEC с большими отклонениями от среднего FEC. Эти результаты согласуются с данными, описанными Coffeng et al ., Которые утверждают, что гомогенизация стула снижает вариации между разными препаратами одного и того же образца стула [31]. В нашем исследовании для образцов А заметного эффекта не наблюдалось. lumbricoides , но размер выборки был относительно небольшим.

Однако для образцов анкилостомы мы наблюдали снижение FEC с увеличением количества циклов перемешивания. В случае A этого не произошло. lumbricoides и T . trichiura FEC. Возможно, из-за того, что яйца анкилостомы являются особенно хрупкими, при увеличении числа циклов перемешивания тонкостепенные яйца анкилостомы разрушались и становились невидимыми для лаборантов. Это открытие требует дальнейшего изучения, поскольку в случае подтверждения гомогенизация образцов с яйцами анкилостомы может иметь важные последствия, такие как недооценка распространенности этого паразита.

Предыдущие исследования показали, что анкилостомоз, A . lumbricoides и T . trichiura яйцо неравномерно распределено в образцах стула [20,23,24,26,27,29]. Krauth и др. . и Ye et al . не обнаружили существенной разницы в FEC или в распределении FEC (в случае Ye и др. .), проанализированных у анкилостомы и T . trichiura пробы взяты с поверхности и центра стула. Интересно, что Krauth et al . обнаружили, что FEC анкилостомы были значительно выше в передней части образца стула, чем в задней части; полная противоположность была найдена для T . trichiura , где FEC были значительно выше в задней части стула по сравнению с передней частью стула. Эти данные свидетельствуют о скоплении яиц, распределенных вдоль оси длины образца. Однако эти два исследования не обнаружили снижения вариации FEC в образцах после гомогенизации (перемешивание в течение 60 секунд и от 15 до 20 минут, в случае Krauth et al и Ye et al ., Соответственно. ) для A . lumbricoides и T . trichiura [24] или любой из трех паразитов [23]. Это можно объяснить небольшим размером выборки этих исследований (от двух до девяти). Также Krauth и др. . не обнаружили никаких изменений в FEC после гомогенизации ни для одного из трех паразитов [23].

Наши результаты показали, что, хотя гомогенизация образцов, по-видимому, снижает вариацию FEC, она также может привести к уменьшению FEC от анкилостомы. Следовательно, неясно, действительно ли гомогенизация увеличивает чувствительность техники Като-Каца.

Наши окончательные рекомендации по технике Като-Кац представлены на рис. 7.

Сильные стороны и ограничения

В других исследованиях в этой области использовались очень маленькие выборки — от двух до 14 образцов цельного стула [23,24,28]. Таким образом, главной сильной стороной нашего исследования является большой размер выборки для всех трех экспериментов. Еще одной сильной стороной нашего исследования является то, что, поскольку оно проводилось в высокоэндемичном для ППГ регионе, многие из наших образцов имели умеренную или тяжелую интенсивность заражения ППГ, чего не было в других исследованиях.

У нашего исследования было несколько ограничений. Во-первых, мы не записали точное время дефекации, что не позволяет нам узнать точный период между получением пробы и ее анализом. Кроме того, мы не измерили точное время от сбора образцов до лабораторной обработки, хотя они имели место в одно и то же утро. В будущих исследованиях следует записывать эти временные точки, чтобы их можно было учесть. Наконец, мы не измерили промежуток времени, необходимый для анализа каждого отдельного слайда Като-Каца, который был бы полезной информацией, чтобы помочь интерпретировать эксперимент с сохранением Като-Каца.Имея эту информацию, мы могли бы точно знать, как долго каждый слайд хранился в холодильнике между точками времени чтения. По нашим наблюдениям, мы подсчитали, что нашим лаборантам потребовалось около восьми минут, чтобы прочитать слайд Като-Каца для всех трех паразитов. Этот промежуток времени соответствует публикации Speich et al ., Которые оценили в среднем 9,5 минут для чтения слайда Като-Каца для всех трех STH [12].

Еще одним ограничением является то, что толстые мазки Като-Каца не распределялись случайным образом между лаборантами.Кроме того, поскольку все три эксперимента требовали строгой пунктуальности, слайды Като-Каца не меняли маркировкой с новыми идентификационными номерами в каждый момент времени, что означает, что лаборанты не были ослеплены, и мы не проводили контроль качества.

Еще одно ограничение касается моментов времени, которые мы выбрали для эксперимента с хранением всего образца. Было бы интересно исследовать другой момент времени позже, в день 0 ( e . g . 8 часов), чтобы исследовать влияние промежутка времени между сбором образца и анализом в течение дня сбора на FEC анкилостомы.В случае эксперимента со слайдом Като-Каца следовало рассмотреть 30-минутный момент времени, чтобы он соответствовал рекомендациям ВОЗ.

Последним ограничением было то, что мы не принимали во внимание консистенцию стула, и это могло иметь некоторое влияние на результаты.

Выводы

Основываясь на наших результатах, мы предлагаем анализировать слайды Като-Каца через 20–30 минут после подготовки слайдов и соответственно пересмотреть рекомендации ВОЗ. Если невозможно прочесть слайды Като-Каца в течение этого периода времени, мы рекомендуем хранить их в холодильнике через 20 минут после приготовления, поскольку мы обнаружили, что это может задержать очистку FEC от анкилостомы до 110 минут.Кроме того, наши результаты показали, что хранение целых образцов стула в течение ночи приводит к значительному снижению FEC анкилостомоза, независимо от температуры, при которой они хранятся. Поэтому мы рекомендуем анализировать все образцы стула в день их сбора (рис. 7). Наконец, мы обнаружили, что наблюдается значительное снижение вариабельности анкилостомы и T . trichiura FEC, когда образцы цельного стула гомогенизируют перед приготовлением слайдов Като-Каца. Поскольку наши результаты также показали, что FEC анкилостомы уменьшаются с увеличением количества циклов перемешивания, трудно дать рекомендации относительно времени перемешивания образца.В будущих исследованиях следует дополнительно изучить причину снижения FEC при гомогенизации.

Вспомогательная информация

S2 Таблица. Эксперимент с хранением всего образца: разница средних значений FEC между условиями хранения анкилостомы,

A . lumbricoides и T . тричиура .

FECs = количество фекальных яиц, A . lumbricoides = Ascaris lumbricoides , T . trichiura = Trichuris trichiura .

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009032.s002

(DOCX)

Благодарности

Мы благодарны всем детям, предоставившим нам образцы стула, сделавшим возможным это исследование, а также их учителям за поддержку. Мы хотим поблагодарить лаборантов, водителей и полевых работников из Лаборатории общественного здравоохранения Иво де Карнери, Чак Чак, Объединенная Республика Танзания, за их самоотверженный и упорный труд.

Ссылки

1. 1.КТО. Гельминты, передаваемые через почву, 2020 г. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/soil-transmitted-helminth-infections.
2. 2. Тарафдер М.Р., Карабин Х., Джозеф Л., Балолонг Э. мл., Ольведа Р., МакГарви С.Т. Оценка чувствительности и специфичности метода исследования кала Като-Каца для выявления анкилостомов, инфекций Ascaris lumbricoides и Trichuris trichiura у людей при отсутствии «золотого стандарта». Int J Parasitol.2010. 40: 399–404. pmid: 19772859
3. 3. Mascarini-Serra L. Профилактика гельминтозов, передаваемых через почву. J Global Infect Dis. 2011; 3: 175. pmid: 21731306
4. 4. Jourdan PM, Lamberton PHL, Fenwick A, Addiss DG. Глистные инфекции, передающиеся через почву. Ланцет. 2018; 391: 252–265. pmid: 28882382
5. 5. Пуллан Р.Л., Смит Д.Л., Ясрасария Р., Брукер С.Дж. Глобальные показатели инфекций и бремени болезней, передаваемых через гельминтозы, в 2010 г.Векторы паразитов. 2014; 7: 37. pmid: 24447578
6. 6. GBD 2017 DALYs и сотрудники HALE. Глобальные, региональные и национальные годы жизни с поправкой на инвалидность (DALY) для 359 заболеваний и травм и ожидаемая продолжительность здоровой жизни (HALE) для 195 стран и территорий, 1990–2017 годы: систематический анализ для исследования глобального бремени болезней 2017 года. Lancet . 2018; 392: 1859–1922. pmid: 30415748
7. 7. Лукас А., Хотез П.Дж., Димерт Д., Язданбахш М., Маккарти Дж. С., Корреа-Оливейра Р. и др.Анкилостомоз. Nat Rev Dis Primers. 2016; 2: 16088. pmid: 27929101
8. 8. Кац Н., Чавес А., Пеллегрино Дж. Простое устройство для количественного анализа толстого мазка кала при мансонном шистосомозе. Rev Inst Med Trop Сан-Паулу. 1972; 14: 397–400. pmid: 4675644
9. 9. Cools P, Vlaminck J, Albonico M, Ame S, Ayana M, Jose Antonio BP и др. Диагностические характеристики одного и нескольких экземпляров Kato-Katz, Mini-FLOTAC, FECPAKG2 и qPCR для обнаружения и количественной оценки гельминтов, передающихся через почву, в трех эндемичных странах.PLoS Negl Trop Dis. 2019; 13: e0007446. pmid: 31369558
10. 10. Bärenbold O, Raso G, Coulibaly JT, N’Goran EK, Utzinger J, Vounatsou P. Оценка чувствительности метода Като-Каца для диагностики Schistosoma mansoni и анкилостомоза в зависимости от интенсивности инфекции. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11: e0005953. pmid: 28976979
11. 11. Speich B, Ali SM, Ame SM, Albonico M, Utzinger J, Keizer J. Контроль качества при диагностике Trichuris trichiura и Ascaris lumbricoides с использованием техники Като-Каца: опыт трех рандомизированных контролируемых испытаний.Векторы паразитов. 2015; 8: 82. pmid: 25652120
12. 12. Спейч Б., Кнопп С., Мохаммед К.А., Хамис И.С., Ринальди Л., Кринголи Г. и др. Сравнительная оценка стоимости методов Kato-Katz и FLOTAC для диагностики гельминтов, передаваемых через почву, в эпидемиологических исследованиях. Векторы паразитов. 2010; 3: 71. pmid: 20707931
13. 13. Николай Б, Brooker SJ, Pullan RL. Чувствительность диагностических тестов на гельминтозы, передаваемые через почву: метаанализ при отсутствии истинного золотого стандарта.Int J Parasitol. 2014; 44: 765–774. pmid: 249

14. 14. Мозер В., Беренболд О., Мирамс Дж. Дж., Коулс П., Вламинк Дж., Али С. М. и др. Диагностическое сравнение между FECPAKG2 и методом Като-Каца для анализа яиц гельминтов, передаваемых через почву, в кале. PLoS Negl Trop Dis. 2018; 12: e0006562. pmid: 29864132
15. 15. Левеке Б., Бенке Дж. М., Аджампур С. С., Альбонико М., Амэ С. М., Шарлье Дж. И др. Сравнение чувствительности и количества яиц в фекалиях с помощью методов подсчета яиц по Макмастеру и метода толстого мазка Като-Каца для гельминтов, передающихся через почву.PLoS Negl Trop Dis. 2011; 5: e1201. pmid: 21695104
16. 16. Бекана Т., Меконнен З., Зейнудин А., Аяна М., Гетачью М., Веркрюсс Дж. И др. Сравнение толстого мазка Като-Каца и метода подсчета яиц по Макмастеру для оценки эффективности лекарств против гельминтозов, передаваемых через почву, у школьников в городе Джимма, Эфиопия. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2015; 109: 669–671. pmid: 26385937
17. 17. КТО. Справочные материалы по диагностике кишечных паразитов, 2-е изд.Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2019.
18. 18. Cringoli G, Rinaldi L, Maurelli MP, Utzinger J. FLOTAC: новые поливалентные методы качественной и количественной копромикроскопической диагностики паразитов у животных и людей. Nat Protoc. 2010; 5: 503–515. pmid: 20203667
19. 19. Бергквист Р., Йохансен М.В., Утцингер Дж. Диагностические дилеммы в гельминтологии: какие инструменты использовать и когда? Trends Parasitol. 2009. 25: 151–156. pmid: 19269899
20. 20. Кнопп С., Мгени А.Ф., Хамис И.С., Стейнманн П., Стотхард Дж. Р., Роллинсон Д. и др.Диагностика гельминтов, передающихся через почву, в эпоху профилактической химиотерапии: эффект многократного взятия проб стула и использование различных методов диагностики. PLoS Negl Trop Dis. 2008; 2: e331. pmid: 18982057
21. 21. Кнопп С., Ринальди Л., Хамис И.С., Стотхард Дж. Р., Роллинсон Д., Маурелли М.П. и др. Один FLOTAC более чувствителен, чем три экземпляра Kato-Katz для диагностики малоинтенсивных гельминтозов, передаваемых через почву. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2009. 103: 347–354. pmid: 1
22. 97
23. 22.Дакомб Р.Дж., Крампин А.С., Флойд С., Рэндалл А., Ндхлову Р., Бикл К. и др. Временные задержки между пациентом и лабораторией выборочно влияют на точность диагностики гельминтов. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2007. 101: 140–145. pmid: 16824566
24. 23. Krauth SJ, Coulibaly JT, Knopp S, Traoré M, N’Goran EK, Utzinger J. Углубленный анализ куска говна: распространение Schistosoma mansoni и яиц анкилостомы в человеческом стуле. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1969. pmid: 23285307
25. 24.Е XP, Доннелли CA, Fu YL, Wu ZX. Неслучайность распределения яиц Trichuris trichiura и Ascaris lumbricoides в фекалиях и эффект перемешивания образцов фекалий. Trop Med Int Health. 1997; 2: 261–264. pmid: 94
26. 25. Андерсон Р.М., Шад Г.А. Бремя анкилостомы и количество фекальных яиц: анализ биологической основы вариации. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1985. 79: 812–825. pmid: 3832493
27. 26. Бут M, Vounatsou P, N’Goran E K, Tanner M, Utzinger J.Влияние усилий по отбору проб и эффективности техники Като-Каца на диагностику Schistosoma mansoni и сопутствующих инфекций анкилостомоза в сельских районах Кот-д’Ивуара. Паразитология. 2003. 127: 525–531. pmid: 14700188
28. 27. Холл А. Количественная изменчивость количества яиц нематод в фекалиях: исследование среди сельских жителей Кении. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1981; 75: 682–687. pmid: 7330922
29. 28. Мартин Л.К., Бивер ПК. Оценка метода толстого мазка Като для количественной диагностики гельминтозов.Am J Trop Med Hyg. 1968; 17: 382–391. pmid: 56

30. 29. Geerts S, Gryseels B. Лекарственная устойчивость гельминтов человека: текущая ситуация и уроки животноводства. Clin Microbiol Rev.2000; 13: 207–222. pmid: 10755998
31. 30. Берхе Н., Медхин Г., Эрко Б., Смит Т., Гедаму С., Бередед Д. и др. Вариации в количестве яиц в фекалиях гельминтов в толстых мазках Като-Каца и их значение для оценки статуса инфекции с Schistosoma mansoni . Acta Trop.2004. 92: 205–212. pmid: 15533288
32. 31. Коффенг Л. Е., Малиция В., Вегвари С., Коулс П., Халлидей К. Э., Левеке Б. и др. Влияние различных схем отбора проб на принятие решений в программах борьбы с гельминтозами, передаваемыми через почву. J Infect Dis. 2020; 221: S531 – s538. pmid: 31829425
33. 32. Palmeirim MS, Bosch F, Ame SM, Ali SM, Hattendorf J, Keizer J. Эффективность, безопасность и приемлемость нового жевательного состава по сравнению с твердой таблеткой мебендазола против анкилостомозов у ​​детей: открытое рандомизированное контролируемое исследование.EClinicalMedicine. 2020; 27: 100556. pmid: 33150325
34. 33. Montresor A, Crompton DW, Gyorkos TW, Savioli L. Контроль гельминтов у детей школьного возраста: руководство для менеджеров программ контроля. Всемирная организация здоровья; 2002.
35. 34. Vlaminck J, Cools P, Albonico M, Ame S, Chanthapaseuth T, Viengxay V и др. Пилотирование системы наблюдения для мониторинга глобальных моделей эффективности лекарств и появления устойчивости к глистогонам в программах борьбы с гельминтами, передаваемыми через почву: протокол исследования Starworms.Gates Open Res. 2020; 16:28 pmid: 32266328

Сравнительная оценка традиционного цитологического исследования и недорогого жидкостного цитологического метода EziPREP ™ для составления отчетов о мазке из шейки матки и влагалища: исследование с разделенными образцами

ВВЕДЕНИЕ

Рак шейки матки по-прежнему поражает большое количество женщин во всем мире, особенно в странах с ограниченными ресурсами, несмотря на то, что это заболевание, которое можно предотвратить с помощью скрининга и выявления предраковых поражений, а в последнее время — вакцинации против вируса папилломы человека (ВПЧ).[1] Организованные программы скрининга шейки матки с использованием цитологии в качестве метода скрининга успешно снизили заболеваемость, а также смертность от рака шейки матки в большинстве развитых стран. [2] Однако, как сообщается, чувствительность мазков из шейки матки, приготовленных традиционным способом, составляет всего 50%, что объясняется такими факторами, как наличие скрывающего кровотечения, воспаление, слизь или заметное перекрытие клеток, что препятствует правильной интерпретации морфологических признаков и приводит к ложным -отрицательные отчеты.[34] В качестве попытки преодолеть эти ограничения была введена жидкостная цитология (ЖЖК) для подготовки монослойных мазков, что позволило избежать скрывающих факторов и снизить количество неудовлетворительных мазков. [5] Различные исследования подтвердили сокращение количества неудовлетворительных образцов с использованием технологии LBC с различными результатами, касающимися скорости обнаружения клинически значимых поражений шейки матки. Однако доступные в настоящее время одобренные устройства для LBC используют дорогостоящее автоматизированное оборудование с высокими эксплуатационными расходами, что сдерживает широкое применение этой технологии для скрининга рака шейки матки в странах с ограниченными ресурсами.[6]

Настоящее исследование было направлено на оценку недорогого местного метода LBC по сравнению с традиционным методом скрининга рака шейки матки в условиях ограниченных ресурсов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поперечное исследование с разделенными образцами было проведено в онкологическом исследовательском центре в течение 6 месяцев (июнь – декабрь 2018 г.) для оценки сравнительной эффективности традиционной цитологии и метода EziPREP ™ (EP). Биопсия, направленная на кольпоскопию, была золотым стандартом в этом исследовании.Исследование было одобрено институциональным этическим комитетом.

Сбор проб

Исследуемая популяция включала женщин, посещающих гинекологическое отделение наших сотрудничающих больниц в рамках программы скрининга на оппортунистический рак шейки матки. После получения информированного согласия образцы шейки матки были собраны с помощью шпателя Эйра и эндоцервикальной щетки. Первоначально готовили обычные мазки, распределяя клетки из обоих устройств для сбора на предварительно пронумерованные предметные стекла и немедленно фиксируя в 95% этаноле.После этого была сломана головка Cervex-Brush во флаконе EP, содержащем 20 мл фиксирующего раствора. Затем образцы были отправлены в лабораторию цитопатологии для дальнейшей обработки и оценки.

Обработка мазков условных

Стандартные мазки окрашивали стандартным окрашиванием по Папаниколау (Пап) с использованием ручного метода окрашивания, применяемого в нашей лаборатории.

Жидкая цитология EziPREP ™

EP — это полуавтоматическая технология, в которой используется запатентованный сепаратор для фильтрации слизи и крови из цервикальных образцов.Образцы обрабатываются в процессоре EP Nanocyt Neo, который использует безфильтровую технологию для получения монослойных мазков. Оборудование имеет встроенные программы с возможностью тестирования нескольких образцов и возможностью получения двойных мазков на одном предварительно покрытом предметном стекле.

Обработка образцов EziPREP ™

Образцы хранили при комнатной температуре до обработки, которая обычно проводилась в тот же день. Этапы подготовки, согласно протоколу производителя, включали наслаивание 7 мл образца после встряхивания над 5 мл разделительного раствора с последующим центрифугированием при 1500 об / мин в течение 5 мин.Супернатант удаляли, осадок встряхивали и загружали (50–75 мкл) в камеру для наноцитов с последующим центрифугированием в процессоре Nanocyt Neo при 1500 об / мин в течение 2 мин с предварительно покрытым предметным стеклом предметным стеклом. Это давало двойные мазки на одном предметном стекле. Срезы фиксировали в 95% этаноле и окрашивали обычным методом окрашивания Пап.

Оценка слайдов

Стандартные препараты (CP), а также препараты, обработанные EP, были оценены слепым методом двумя опытными цитопатологами (SG и RG) на предмет качества окрашивания, цитоплазматических и ядерных деталей.О мазках сообщалось в соответствии с действующей системой отчетности Bethesda (2014) по цитологии шейки матки и влагалища [7]. После оценки слепым методом мазки были расшифрованы и объединены в пары. Случаи несоответствия между диагнозом ХП и ВП были рассмотрены третьим патологом (РМ), мнение которого было признано окончательным. Сравнение этих двух методов было проведено с использованием критерия хи-квадрат.

Результаты биопсии шейки матки во включенных случаях, если таковые были, коррелировали с диагнозами ХП и ВП.О биопсии шейки матки сообщалось в соответствии с классификацией цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) [8]. Цитолого-гистологическая корреляция была выполнена в соответствии с рекомендациями Американского общества цитопатологов (2017) с использованием сетки оценки расхождений [9]. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность (PPV) для диагностики поражений CIN2 + были рассчитаны как для CP, так и для EP на пороге цитологии ASC-US.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Возраст женщин, включенных в исследование, составлял от 22 до 80 лет (средний возраст: 40.5 лет). Из 515 женщин большинство (86%) предъявляли незначительные жалобы, такие как выделения из влагалища, боли в пояснице или животе.

Цитологическое исследование

Из включенных случаев 5 (1,0%) были неудовлетворительными для оценки ХП, в то время как 7 (1,3%) ВП были неудовлетворительными, в основном из-за неадекватного клеточного материала. Общее качество окрашивания мазков как ЦП, так и ВП было удовлетворительным со сравнимыми морфологическими деталями [Таблица 1].

Таблица 1: Качество окрашивания 515 парных мазков из шейки матки, обработанных традиционными методами и методами EziPREP ™

Параметр	CP	EP	P (критерий хи-квадрат)
Границы ячеек
Отдельно	428 (83.1)	437 (84,8)	0,44
Нечеткое	87 (16,9)	78 (15,2)
Окрашивание цитоплазмы
Отлично	103 (20)	118 (22,9)	0,12
Удовлетворительно	322 (62,5)	329 (63,8)
Неудовлетворительно	90 (17,4)	68 (13,2)
Ядерные границы
Отдельно	430 (83.5)	433 (84,1)	0,79
Нечеткое	85 (16,5)	82 (15,9)
Хроматин
Хрустящий	397 (77,1)	388 (75,3)	0,51
Мутный	118 (22,9)	127 (24,7)

В обоих методах ядерный хроматин выглядит четким и легко интерпретируемым, а ядерные мембраны хорошо разграничены.Качество окраски цитоплазмы одинаково сохранялось как в мазках, взятых из CP, так и в EP, как показано на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1: Панель микрофотографий, демонстрирующих обычный (а) и соответствующий мазок EziPREP ™ (b) отсутствие интраэпителиального поражения, злокачественных новообразований или NILM. Обычный мазок показывает несколько грибковых гиф в случае кандидоза (c), тогда как гифы видны более четко в мазке EziPREP ™ в том же случае (d). Только несколько разбросанных трофозоитов Trichomonas vaginalis видны в обычном мазке (e) по сравнению с мазком EziPREP ™, показывающим многочисленные легко различимые трофозоиты (f) (a-f: Pap, × 400)

Экспорт в PPT

Рисунок 2: Соответствующие стандартные (а) мазки и мазки EziPREP ™ (b) демонстрируют аналогичные характеристики в случае плоскоклеточного интраэпителиального поражения низкой степени с изменениями ВПЧ.Случай плоского интраэпителиального поражения высокой степени с атипичными клетками в стандартном (c) и мазке EziPREP ™ (d) (a-d: Пап, × 400)

Экспорт в PPT

Методом

EP были получены монослойные мазки диаметром более 16 мм. Перекрытие и скученность клеток были минимальными в мазках с ВП, тогда как это было частой особенностью в препаратах ЦП. Фон мазков, полученных методом ВП, был чистым, полиморфы агрегировали, чтобы сформировать четко идентифицируемые кластеры, и слизи в этих мазках также было значительно меньше.Эритроцитов было мало в мазках EP, и там, где они присутствовали, они выглядели как фантомные изображения. С другой стороны, соответствующие мазки КП показали, что полиморфы распределены по всему мазку, иногда скрывая детали клеток. Количество эритроцитов было больше, и они иногда мешали интерпретации мазков. Однородные тонкие мазки EP с отсутствием затемняющих факторов было относительно легче скрининговать и регистрировать. Среднее время, необходимое для скрининга и отчета о мазке ХП, составило 6,5 мин по сравнению с 2,2 мин для мазка ВП.

Частота различных цитологических диагнозов в 508 случаях, которые были адекватны как методами ХП, так и ВП, представлена ​​в Таблице 2.

Таблица 2: Частота цитологических диагнозов при удовлетворительных обычных препаратах и ​​мазках EziPREP ™

Цитологический диагноз	Стандартный мазок	EP мазок	п.
НИЛМ	488	483	0.36
Кандида	7	11	0,33
Изменение флоры (бактериальный вагиноз)	58	65
Trichomonas vaginalis	5	7
Аномалии эпителиальных клеток (%)	20 (3,9)	25 (4,9)	0,44
ASC-US	5	8
ASC-H	2	2
LSIL	3	5
HSIL	5	5
Злокачественные	3	3
AGC-NOS	2	2

Соответствие двух методов

Было оценено соответствие между этими 508 мазками для морфологического диагноза по мазкам ХП и ВП [Таблица 3].Из 508 случаев 481 (94,6%) оказались отрицательными при использовании обоих методов. При CP 20 (3,9%) были зарегистрированы как поражение ASC-US и выше, в то время как диагноз ASC-US + был поставлен в 25 мазках (4,9%), подготовленных EP. Общая степень соответствия между ХП и ВП составила 98% (498 из 508 случаев). Соответствие составило 98,7% для отрицательных интраэпителиальных поражений или злокачественных новообразований (NILM), 40% для ASC-US, 100% для плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкой степени (LSIL), плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени (HSIL), карциномы и атипичных желез. клетки — не указано иное (AGC-NOS), принимая диагноз ХП в качестве знаменателя.Из шести случаев, диагностированных как ASC-US при EP и NILM при CP, повторный мазок, выполненный через 4–6 недель, показал разрешение патологии в трех случаях, в то время как стойкое ASC-US наблюдалось в трех случаях. Обзор мазков ХП в этих случаях не смог выявить клетки, которые можно было бы обозначить как ASC-US. Один случай показал несоответствие между CP и EP в том, что в первом случае они назывались NILM, а во втором — LSIL. Обычный анализ мазка в этом случае выявил несколько разбросанных клеток с морфологическими особенностями, соответствующими LSIL, которые были упущены во время первоначального скрининга.

Таблица 3: Соответствие между обычными препаратами и мазками EziPREP ™ для цитологической диагностики

EP мазок	Стандартный мазок
	НИЛМ	ASC-US	ASC-H	LSIL	HSI L	Злокачественное	AGC-NOS
НИЛМ	481	2	0	0	0	0	0
ASC-US	6	2	0	0	0	0	0
ASC-H	0	0	1	0	1	0	0
LSIL	1	1	0	3	0	0	0
HSIL	0	0	1	0	4	0	0
Злокачественные	0	0	0	0	0	3	0
AGC-NOS	0	0	0	0	0	0	2

Цитолого-гистологическое соответствие

Гистологические данные были доступны в 307 из 508 случаев (60.4%), как показано в Таблице 4. По корреляции цитологического диагноза с биопсией шейки матки согласие было замечено в 296 (96,4%) случаях при ХП и 96,1% (295 случаев) в мазках ВП. Следует отметить открытие, что три случая CIN1 и один случай CIN2 были пропущены на CP, что называется NILM. Один случай CIN2 также не был обнаружен на мазках из EP и был отмечен как NILM. В одном случае (0.3% из 307 случаев с корреляцией биопсии) как на мазках ХП, так и на ВП. Как в группе ХП, так и в группе ВП незначительное несоответствие (на один балл выше или ниже) было отмечено в 10 случаях (3,2%).

Таблица 4: Цитолого-гистологическая корреляция обычных препаратов и мазков EziPREP ™

Гистологический диагноз	Цитологическая диагностика
	НИЛМ		ASC-US		ASC-H		LSIL		HSIL		Злокачественное		AGC-NOS
	CP	EP	CP	EP	CP	EP	CP	EP	CP	EP	CP	EP	CP	EP
Отрицательный	283	281	3	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
КИН 1	3	0	1	2	0	0	2	3	0	0	0	0	0	0
КИН 2-3	1	1	1	2	2	2	1	2	5	4	0	0	0	0
Карцинома	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	3	3	0	0

Характеристики испытаний

Чувствительность, специфичность и PPV для CP и EP были сопоставимы на пороге ASC-US [Таблица 5], принимая поражение CIN2 + при биопсии в качестве золотого стандарта отсечки для положительности.

Таблица 5: Тестовые характеристики обычных (обычных препаратов) и препаратов EziPREP ™

Цитологический порог	Вид подготовки	Чувствительность (%)	Специфичность (%)	PPV (%)
ASC-US	CP	93,3	98,6	77.7
	EP	94,1	96,8	64

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании сравнивается недорогая методика LBC с традиционной подготовкой мазка для цитологии шейки матки. Хотя в сравнительных исследованиях было показано, что чувствительность и специфичность LBC в обнаружении высокозлокачественных поражений более или менее схожи, снижение количества неудовлетворительных образцов, ясность фона и небольшая площадь для скрининга с результирующим улучшением. эффективность привела к переходу на технику LBC в большинстве западных стран.[10] Однако высокая стоимость доступных в настоящее время одобренных устройств для приготовления образцов БКК препятствует их широкому применению в странах с ограниченными ресурсами. Следовательно, предпринимаются усилия по разработке недорогих методов или устройств, обеспечивающих сопоставимый монослой с четким фоном, как это видно на коммерчески доступном оборудовании. Ручные методы подготовки мазка LBC были оценены в нескольких исследованиях с разными результатами. [1112] Другие недорогие методы LBC, такие как Liqui-PREP ™ (центрифугирование — добавление клеточной основы — центрифугирование и подготовка предметных стекол пипетированием), Pap Spin ^® (подготовка мазка на основе цитоспина), Turbitec ^® (центрифугирование на предметном стекле с полилизином) ) и цитоскрин (на центрифуге) сравнивали с обычным мазком Папаниколау по морфологическим параметрам и скорости выявления интраэпителиальных поражений.Большинство этих исследований показали более низкую частоту получения неудовлетворительных образцов, лучшие морфологические детали и улучшенное цитолого-гистологическое соответствие в методах LBC. [31314] В настоящем исследовании оценивалась полезность одного такого местного метода для выявления предраковых поражений шейки матки, а также оценивались его характеристики обработки и окрашивания, чтобы обеспечить легкую адаптацию средств цитоскрининга и цитопатологов. Сравнение стандартной цитологии шейки матки и одного из методов LBC может быть проведено с использованием дизайна исследования «разделенный образец» или «прямой ввод во флакон».У обоих есть достоинства и недостатки. Процедура «разделенной выборки» позволяет сравнивать одну и ту же исследуемую популяцию. С другой стороны, дизайн исследования «напрямую во флакон» включает сравнение с обычными мазками идентичной, но не той же популяции, поскольку образец индивидуума обрабатывается одним из методов, но не обоими. [15] Мы провели исследование с разделенными образцами, чтобы оценить рабочие характеристики местного недорогого аппарата LBC, EP по сравнению с традиционным цитологическим исследованием.Золотым стандартом была биопсия под контролем кольпоскопии.

Более ранние отчеты, сравнивающие традиционные препараты и препараты на жидкой основе для цитологического исследования шейки матки, показали значительное снижение частоты неудовлетворительных результатов до <2% в LBC. [1016] Однако неудовлетворительная частота ХП в нашем исследовании была заметно низкой, поскольку образцы шейки матки собираются обученными медико-социальными работниками. В настоящем исследовании неудовлетворительная частота была несколько выше для мазков с ВП, в основном из-за неадекватной клеточности.Это могло произойти, поскольку обычные мазки были приготовлены до помещения того же устройства для сбора во флакон с ЕР. Ни один из мазков EP не показал заметного затемнения кровью или воспалительными клетками. Несмотря на это, LBC действительно способствует лучшей подготовке мазка и снижает неудовлетворительные показатели для большинства лабораторий, практикующих гинекологическую цитологию.

Инфекционные патологии, такие как Candida , сдвиг во влагалищной флоре, Trichomonas vaginalis , более четко оценивались в мазках EP, хотя разница в частоте выявления не достигла статистической значимости.Более четкий фон в EP облегчил специалистам по скринингу и патологам обнаружение кандидозных гиф. В одном случае мазок ЦП показал небольшие очаги некроза и разбросанные эпителиоподобные клетки, в то время как ВП выявил хорошо сформированные гранулемы, помогающие поставить предположительный диагноз туберкулезного цервицита по цитологическому исследованию. Несколько более ранних исследований также подчеркнули легкость выявления инфекционной этиологии на препаратах LBC [1017], как и в настоящем исследовании.

Частота сообщений о ASC-US была выше в мазках из ВП, чем в случаях ХП.Этот вывод согласуется с более ранними исследованиями, сравнивающими LBC и CP. [18] Гистологическая корреляция этих увеличенных случаев ASC-US в настоящем исследовании выявила два случая, каждый из которых был диагностирован как CIN1 и CIN2 при биопсии шейки матки. Хотя в настоящем исследовании было обнаружено, что чувствительность и специфичность как CP, так и EP для обнаружения поражений CIN2 + схожи, необходимы более крупные исследования, чтобы определить клиническую значимость повышенного выявления поражений низкой степени злокачественности на мазках EP.Также было обнаружено, что частота LSIL была выше на EP по сравнению с CP, хотя разница не была статистически значимой. Более высокое обнаружение низкосортных поражений при ВП, аналогично более ранним исследованиям, сравнивающим LBC и CP, приписывается лучшей клеточной морфологии на более чистом фоне с минимальным перекрытием клеток, что позволяет поставить более точный диагноз [18]. Однако частота обнаружения HSIL и более высоких поражений была одинаковой в обоих методах (CP и EP). В предыдущих исследованиях сообщалось о различных результатах, касающихся преимущества методов LBC при обнаружении предраковых поражений шейки матки.Некоторые авторы показали, что LBC более чувствительна и специфична при обнаружении поражений шейки матки по сравнению с CP. [19] Другие исследования, включая систематический обзор, не обнаружили заметной разницы в доле высокозлокачественных поражений, обнаруживаемых двумя методами. [2021] Один общий вывод, о котором сообщается в большинстве исследований, — это снижение неудовлетворительных показателей в LBC, что приводит к бескомпромиссной отчетности. Из трех дополнительных поражений ASC-US, обнаруженных на ВП в настоящем исследовании, два были подтверждены как CIN2 при биопсии.Среди категории LSIL один из дополнительных случаев, выявленных на EP, был зарегистрирован как CIN2 при биопсии. Следовательно, частота выявления клинически значимого поражения шейки матки была выше при ЕП по сравнению с КП. Тестовые характеристики обоих методов были сопоставимы в нашем исследовании с немного более высокой чувствительностью и меньшей специфичностью и PPV для EP по сравнению с CP. Это может быть связано с большим количеством поражений ASC-US, обнаруженных в мазках EP, способствующих ложноположительным результатам.

Система EP, оцениваемая в настоящем исследовании, использует простую технику для приготовления монослоя клеток без использования дорогостоящего оборудования, которое требуется для доступных в настоящее время устройств, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (USFDA).Это первое исследование, оценивающее полезность EP в скрининге рака шейки матки. Для адаптации цитопатологов к мазку, подготовленному EP, потребовалось всего 2–3 недели, после чего значительно сократилось время, необходимое для скрининга мазков из шейки матки. Время, затраченное на обработку образцов и приготовление окрашенного мазка в методе ЭП в настоящем исследовании, составляло около 30 минут для партии из 12 образцов (2,5 минуты на образец) по сравнению с примерно 40 минутами для партии из 25 стандартных мазков. окрашены вручную (1.6 мин на слайд). Однако это несколько меньше времени, необходимого специалисту для коммерческих систем на жидкой основе. [22] Время считывания мазка значительно сокращается с 6,5 минут в CP до 2,2 минут в мазке EP (монослой в круге диаметром 16 мм), что может привести к получению большего количества мазков за одно и то же время с меньшей утомляемостью как специалистов по скринингу, так и цитопатологов и, следовательно, повысить эффективность лаборатории. Также доступна опция двойного мазка из одного и того же образца, каждый по кругу диаметром 16 мм, что увеличивает количество проверяемых клеток и повышает точность скрининга рака шейки матки.Хотя мы не проводили тестирование на ВПЧ остаточного образца во флаконах EP, в технической брошюре продукта упоминается, что этот материал подходит для использования в тестировании ДНК ВПЧ. [23]

Подробный анализ затрат выходит за рамки данной статьи. Однако краткое сравнение стоимости реагентов показало, что стоимость одного теста для наборов EP была примерно в 1,5 раза ниже, чем у коммерчески доступных процессоров LBC, одобренных USFDA. Кроме того, первоначальная стоимость оборудования для EP была намного меньше, чем для коммерчески доступного полуавтоматического оборудования LBC.В то же время время, затрачиваемое на подготовку мазков из шейки матки с использованием полуавтоматических методов, таких как EP, по сравнению с коммерчески доступными утвержденными полностью автоматизированными процессорами LBC, необходимо учитывать при анализе затрат.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Это недорогое устройство LBC обещает предоставить монослойные мазки из шейки матки с четким фоном и лучшей клеточной морфологией, чем CP. Выявление инфекционных патологий, а также низкосортных поражений было лучше, хотя и не статистически значимо, в жидких мазках по сравнению с обычными мазками.Следует предпринять более широкую доступность и многоцентровую оценку производительности таких недорогих устройств LBC. Если будет обнаружено, что он превосходит традиционную цитологию, это может проложить путь для программного включения скрининга рака шейки матки на основе цитологии в более крупном масштабе в странах с ограниченными ресурсами с обеспечением проведения тестирования на ВПЧ на остаточном образце.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИНТЕРЕСАХ ВСЕХ АВТОРОВ

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ АВТОРЕ ВСЕХ АВТОРОВ

Все авторы этой статьи заявляют, что мы имеем право на авторство согласно определению ICMJE http://www.icmje.org/#author.

Каждый автор в достаточной степени участвовал в работе и взял на себя общественную ответственность за соответствующие части содержания этой статьи.

RG задумал и разработал исследование, участвовал в отборе, сравнительной оценке и цито-гистологической корреляции, а также написал и отредактировал рукопись.RY производил препараты EziPREP, включая окрашивание. AS и DK принимали участие в приготовлении традиционных мазков, первичном скрининге мазков из шейки матки. Сандип проводил гистопатологию биопсий шейки матки и помогал в цитогистокорреляции. RM участвовал в сравнительной оценке и помогал в составлении черновика и критическом обзоре рукописи. SG концептуализировал и спроектировал исследование, подписал случаи, выполнил сравнительную оценку и цито-гистологические корреляции, а также помог в черновом и критическом обзоре рукописи.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ЭТИКЕ ВСЕХ АВТОРОВ

Это исследование было проведено с одобрения Институционального наблюдательного совета учреждения, связанного с этим исследованием. Авторы берут на себя ответственность за ведение соответствующей документации в этом отношении.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ (в алфавитном порядке)

AGC-NOS — Атипичные железистые клетки — не указано иное

ASC-US — Атипичные плоскоклеточные клетки — неопределенное значение

ASC-H — Атипичные плоскоклеточные клетки — нельзя исключить HSIL

CIN — Цервикальная интраэпителиальная неоплазия

CP — Обычная подготовка

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

EP — EziPREP ™

ВПЧ — Вирус папилломы человека

HSIL — плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени

LBC — Жидкостная цитология

LSIL — плоскоклеточное интраэпифелиальное поражение низкой степени

NILM — отрицательный результат на интраэпителиальное поражение или злокачественное новообразование

Пап — Папаниколау

PPV — Положительная прогностическая ценность

TBS — Система Bethesda

USFDA — Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.