by : alexxlab Разное

Эллада горина: Эллада Горина | Facebook

Эллада Горина о том, как подружиться с раком: «Мне подарили сокровище в неприглядной обертке» — ФОТО | 1news.az

Она радовалась солнечной погоде, умилялась мимо проходящим кошкам, излучала неиссякаемую жизненную энергию и позитив. И я никак не могла поверить, что пришла на интервью с человеком, который болен раком.

Эллада Горина – известный психотерапевт. На своей странице в Facebook она подробно рассказывает об эмоциях и переживаниях, связанных со своей болезнью. Она хочет успеть привнести как можно больше пользы в этот мир, давая мотивацию многочисленным людям, которые читают ее посты. Представляем вашему вниманию исповедь этой потрясающей женщины, которая подружилась с раком.

«Когда я узнала, что больна раком – я испытала облегчение и радость»

Рак щитовидной железы у меня обнаружился совершенно случайно. Я пошла в клинику на плановый осмотр, и врач заметил небольшую опухоль со всеми признаками злокачественности. Он сказал, что нужно делать биопсию для окончательного подтверждения диагноза. По результатам биопсии было установлено, что у меня действительно рак, причем с высокой степенью злокачественности – из шести возможных уровней у меня оказался пятый.

Какая первая мысль промелькнула в моей голове? Когда я говорю об этом, большинство людей удивляются и не верят, но это абсолютная правда. Я испытала облегчение и радость. И подумала: слава Богу, наконец, случилось то, что развернет мою жизнь.

У меня было ощущение, что я похожа на яхту, которая хорошо проводит время на каком-то побережье. Но ведь яхта создана не для того, чтобы стоять в заливе, она для того, чтобы бороздить морские просторы. Моя жизнь шла по какой-то накатанной дорожке, я занималась одними и теми вещами, любила свою работу, клиентов, семью, друзей, было очень интересно, но… Я понимала, что застряла, что мне нужно двигаться дальше. У меня, как у любого человека, есть миссия в этом мире.

Именно поэтому, когда я узнала, что больна раком, я испытала огромное облегчение. Я поняла, что мне подарили настоящее сокровище, просто в неприглядной обертке.

Не скрою, минут через пять на меня напала какая-то обида, что рак нарушит мою комфортную и налаженную жизнь. Помню, в тот момент я стояла на балконе и ухаживала за своими цветами. И тут у меня покатились слезы. Я поливала цветы водой из лейки и одновременно своими слезами, как вдруг мимо пролетел красивый мотылек – бражник. Я посмотрела на него и подумала: наверное, это просто событие в череде всех остальных жизненных событий. Его нужно просто принять.

«Я встретилась с огромной поддержкой»

Я всегда была человеком, который думает о своих близких людях. Поэтому я задумалась, как именно им сообщить о своей болезни. С детьми я делилась всеми новостями на каждом этапе обследований, потому что у нас доверительные отношения. Я считаю, что детей нужно беречь, но нельзя ограждать их от правды жизни. Им надо учиться переносить трудности, потому что они еще неоднократно с ними столкнутся.

Что же касается старших членов семьи – мамы и тети, здесь было сложнее. Если терять своего родителя – это больно, но закономерно и в нас заложены силы, чтобы это перенести, то терять своего ребенка – совсем другое дело. Поэтому им я сказала уже после проведения биопсии и стопроцентной уверенности в том, что у меня рак.

И, конечно, тяжело было сообщать эту новость своим друзьям. Для меня друзья – это те же члены семьи. Несмотря на то, что мы не связаны кровно, между нами есть такая же глубокая духовная связь.

Я встретилась с огромной поддержкой окружающих меня людей, среди которых были даже подписчики с Фейсбука, никогда не видевшие меня в жизни. Каждый из них будто достал из своей души по одному перу, чтобы у меня появились крылья. А еще мне попались просто замечательные врачи. Многие говорят, что в Азербайджане нет хороших медицинских работников, но я с этим не согласна. Конечно, среди них есть люди, не достойные звания врача, но есть настоящие профессионалы и герои. Именно с такими мне посчастливилось лечиться от рака.

«Эта болезнь пришла ко мне, чтобы я начала меняться»

Когда человек заболевает раком, он должен понять две основные вещи: ПОЧЕМУ это со мной произошло и, что еще важнее, ДЛЯ ЧЕГО? У каждого человека ответы на эти вопросы будут разными, ведь каждый случай индивидуален. Я поняла, ДЛЯ ЧЕГО в мою жизнь постучался рак – для того, чтобы я начала более масштабно служить людям.

Одним из моих действий в этом направлении стала написанная мною в социальных сетях череда постов, в которых я рассказывала о своей болезни, делилась переживаниями и тем, как я справляюсь. Что удивительно – эти откровения оказалась полезны не только онкологическим больным, но и людям с другими заболеваниями и даже людям без каких-либо заболеваний, просто находящимся в тяжелой жизненной ситуации. Очень многие писали мне благодарственные сообщения, говорили, что в моих постах находят ответы на свои вопросы и черпают силу. И служа таким образом людям, я чувствую, как на меня с неба спускается милость. Я считаю, что Вселенная меня любит, раз она наградила меня раком.

Что же касается первого вопроса: ПОЧЕМУ это со мной произошло, на него я тоже нашла ответ. Я осознала одну вещь – как и большинство людей, я часто бывала эгоистична и манипулировала другими для достижения эмоционального или иного благополучия. У рака, помимо чисто физической, имеется и психосоматическая природа, во многом связанная с нашим образом мышления. И он пришел ко мне в том числе для того, чтобы я переосмыслила свою жизнь и начала меняться.

«Без благодарности наше сердце превращается в помойное ведро»

Многие люди избегают больных раком, потому что боятся заразиться. Частично, они правы (улыбается). Мы считаем такую позицию примитивной, но в ней заложена некая мудрость, как бы странно это ни звучало. Конечно, больные клетки не перелетят от одного человека к другому, но есть такое понятие, как «раковое мышление», и им запросто можно заразиться.

Раковое мышление – это мышление обиженного человека. Человека, который считает, что ему все должны. Который чувствует себя жертвой, истязает себя изнутри и постоянно ноет. Находясь долгое время в его обществе, мы поневоле становимся такими же. Поэтому избегать людей с раковым мышлением – это в какой-то степени здраво.

Я очень старалась не стать носителем ракового мышления. Училась быть оптимистом и позитивным человеком. Но не в том замыленном смысле этого слова. Все мы привыкли воспринимать позитив как постоянную улыбку, в том числе и когда тебе плохо внутри, но ты заставляешь себя быть сильной. Когда у тебя на душе скребут кошки, сочится рана, но ты всем демонстрируешь наигранное хорошее настроение, убеждая окружающих и саму себя, что ты справляешься. Это не позитив – это хроническое убивание себя. И при таком подходе человек очень быстро выгорит.

Настоящий позитив – это совсем другое. Это когда ты в трудной ситуации находишь положительную сторону, а не делаешь вид, что все хорошо.

Приведу пример. Во время одного из походов в клинику я вспомнила, что пару лет назад была здесь с человеком, которого очень любила. У этого человека были большие проблемы со здоровьем, и мы приходили сюда сдавать анализы и проходить процедуры. Сама я в тот день пришла в эту клинику одна. Я могла бы начать испытывать жалость к себе и обиду от того, что человек, которого я когда-то поддерживала, сейчас не пришел поддержать меня. Но это было бы раковым мышлением. И вместо этого я начала испытывать радость от того, что мне посчастливилось быть рядом с кем-то в трудный момент. Что я смогла оказаться ему полезной.

Или другой пример. Когда врачи сказали, что мне необходима операция, я понимала, что оставшуюся жизнь мне придется принимать гормоны и, возможно, я буду чувствовать себя инвалидом. Но когда у меня возникали такие мысли, я говорила себе «стоп». Сейчас я встаю утром, беру свою таблеточку, смотрю на нее и улыбаюсь. И мысленно благодарю всех тех научных деятелей и фармацевтов, благодаря которым она существует. Если раньше людям вырезали щитовидку, и у них происходило нарушение метаболизма, то сейчас от этого имеется лечение. И вместо того, чтобы нервничать из-за того, что я чувствую себя инвалидом, я говорю «спасибо» за то, что эта таблетка есть и за то, что я могу позволить себе ее купить.

Это огромная милость свыше – видеть вот эту сторону. Потому что без благодарности наше сердце превращается в помойное ведро.

Но я, конечно, не пришла к этому сразу. Раньше, несмотря на все мои попытки, меня периодически накрывало. Были даже моменты, когда я ходила по дому в отчаянии, измученная, уставшая от всего происходящего и билась головой об стенку. Как бы ты ни старался контролировать свое мышление, эта болезнь, как огнедышащий дракон, хочет пробиться.

 А еще я помню, как однажды лежала у себя дома на полу, из моих глаз катились слезы, и мне было ужасно себя жаль. Вдруг будто голос сверху укоризненно сказал мне: ага, к нам опять пришли «раковые мысли»? Ты лежишь в роскошной квартире в центре города, ты такая красивая и успешная, у тебя есть любящая семья, которая помогает оплатить все дорогостоящие процедуры, прописанные врачами, у тебя за плечами отличная жизнь, которая, кстати говоря, продолжается… И чего ты себя жалеешь?

Этот голос заставил меня встать и записать эти мысли для своей будущей книги. Сейчас я уже не испытываю ни страха, ни обиды, ни жалости к себе, но раньше мне приходилось с этим бороться. Особенно по ночам.

«Я лежала на операции и думала: когда же этот ад закончится»

При раке щитовидки болевых ощущений в области этого органа не бывает, но в целом человек испытывает сильное недомогание: постоянное утомление на грани обмороков, учащенное сердцебиение. При этом медицинское решение традиционно одно – это удаление щитовидки и окружающих лимфатических узлов. Никакого другого лечения данный вид рака не предполагает. Даже химиотерапию здесь не проводят. Только лучевую терапию, но уже после операции.

Стоит отметить, что у меня очень высокая чувствительность и низкий болевой порог, поэтому любая процедура дается мне довольно тяжело. Я испытываю такую боль, что, кажется, сейчас умру. Даже место уколов бывает покрыто синяком на протяжении десяти дней – да так, что к этому месту бывает невозможно прикоснуться. Но самые неприятные впечатления у меня остались от биопсии и от самой операции.

У меня была очень твердая злокачественная опухоль, и врач сказал: «Если я сделаю местный наркоз, ткани отекут, я не смогу пробить ее иглой и взять материал». Общий наркоз тоже нельзя давать, потому что в скором времени мне предстояла операция, а дважды давать общий наркоз за короткий срок нельзя.

В общем, кое-как с помощью лидокаина мне сделали биопсию. Было очень тяжело, потому что пришлось сделать 5 проколов на шее и так получилось, что по случайному стечению обстоятельств меня в больницу в тот день никто не сопровождал. Кто-то проспал, кто-то спутал дни, у кого-то возникли свои дела. В принципе, все мы люди, я с этим смирилась и поняла, что извлеку из этого урока только пользу, если его усвою. Зато со мной рядом в этот момент были все врачи, которые вели мою болезнь. Они держали меня за руку, разговаривали со мной и носились как с ребенком. И я осознала, что никогда не останусь одна. Потому что мир всегда будет за меня.

Когда процедура была завершена, врач посадила меня в такси, и я решила сделать селфи, просто чтобы посмотреть, как я в этот момент выгляжу. У меня был такой измученный вид. Тут я поняла, что должна сделать выбор. Жалеть себя, что никто из моих друзей и родных не смог сегодня прийти, или устроить праздник, порадоваться тому, что я это выдержала. И я выбрала праздник.

Я созвонилась с одним человеком и отправилась с ним в мини-путешествие. Было очень много приключений, о которых я не хочу рассказывать, потому что это – личное (улыбается). С пятью дырками на шее я умудрилась замечательно провести время и наполнить остаток дня радостью.

Но самым настоящим испытанием была для меня операция по удалению щитовидки. Мне сделали интубационный наркоз и вставили трубку. Во время погружения в сон у меня потихоньку отключались мышцы, но при этом какое-то время я продолжала оставаться в сознании. Это был очень тяжелый момент, я думала о том, когда же, наконец, засну, и этот ад закончится. Я поняла, что ничего не могу сделать – только просить у высшей силы мужества это перенести.

Это были самые неприятные переживания. Но сейчас, оборачиваясь назад, я благодарна за то, что это было. Я очень многое узнала о своих способностях, о том, что могу выдержать любую боль. В то же время я поняла, что больше не готова платить такую цену. Этот шрам у меня на шее – мой кошелек. Я будто открыла свое тело и расплатилась за свои ошибки и за прошлое поведение, чтобы начать новую жизнь. Рак будто сказал мне: хочешь жить – меняйся. Я поменялась и закрыла этот кошелек. Таким образом, можно сказать, операция поделила мою жизнь на «до» и «после».

«За месяцы лечения истощились мои финансовые запасы»

В связи с болезнью врачи поставили мне работу под запрет. Они сказали, что у меня совершенно не осталось энергии, и ее нужно направлять на выздоровление, на процедуры, на практики, на работу над собой, но ни в коем случае не на работу с другими. Потому что этим я могу себе навредить.

Кроме того, еще до операции я понимала, что выросла из психотерапии. Эта история моей жизни закончена, и мне нужно идти дальше. В свое время я поставила перед собой цель – зарабатывать своим любимым делом. Пусть другие считают, что на этом в Азербайджане не заработаешь, я стану человеком, который сможет достойно себя обеспечивать только при помощи психотерапии. И с божьей помощью это случилось. Я стала работать с российскими, зарубежными рынками, перестроила свой стиль работы, назначила совершенно другие цены и добилась своей цели. Это – предмет моей гордости.

Теперь же, по указанию врачей и рекомендациям моей целительницы, я перестала работать. Безусловно, это создает мне определенные трудности, потому что за несколько месяцев дорогостоящего лечения мои запасы истощились, и сейчас я с огромной благодарностью принимаю помощь своей семьи, своей сестры. Раньше мне даже представить было сложно, что меня будут содержать другие люди. Но потом я столкнулась с удивительным феноменом: я поняла, что противиться принимать помощь от окружающих – это своего рода гордыня.

Я сама всю жизнь отдавала 10 процентов своего заработка на благотворительность – нуждающимся людям, имеющим какие-то заболевания, приютам для животных и так далее. Я никогда этого не афишировала, потому что делала это для самой себя. И если бы мне кто-то сказал: Лада, не нужно давать мне денег, я бы почувствовала, что меня ущемляют. А потом, когда я оказалась в другом лагере, я пыталась ущемить людей, которые хотели помочь мне.

Сейчас я уже созрела для того, чтобы признать – мне нужна помощь. Возможно, я даже буду просить ее у своих подписчиков на Фейсбуке. Я попробую предложить что-то взамен: проведу бесплатные прямые эфиры на интересующие темы или придумаю что-то еще. Я буду просить деньги у людей не на лечение, а на то, чтобы жить. Чтобы иметь возможность есть, пить, отдыхать, развлекаться, дальше получать образование, развиваться и снова быть полезной людям. Когда-то помощь исходила от меня, сейчас будут помогать мне, а в дальнейшем, может, снова буду помогать я. Такой вот круговорот.

«После поездки на Алтай произошло настоящее чудо»

Ехать в Алтайский край к целительнице Анне я планировала еще до операции. В тот период я познакомилась с многочисленными целителями, знахарями, шаманами, но именно с ней, по словам моего астролога, у меня совпали натальные карты. При этом я – здравомыслящий человек. У меня нет убеждения, что официальная медицина – это плохо, а народная медицина – хорошо, или наоборот. Я считаю, что в этом мире работает абсолютно все. Просто нужно понять – что конкретно на данном этапе может тебе помочь?

Когда я пошла на очередное обследование, врач сказал, что мое состояние резко ухудшается, и я нахожусь на грани метастазов. Нужно было срочно делать операцию и вырезать щитовидку. После операции мы снова провели биопсию, и оказалось, что раковые клетки уже успели выйти за пределы органа. При таком раскладе пациенту стандартно делают облучение. Но мой врач сказала: «Давай оттянем эту процедуру, дадим твоему организму шанс справиться самому. Вдруг произойдет чудо?» И я поняла, что должна использовать это время для поездки к Анне в Алтайский край.

Я знала, что меня ждут очень серьезные перемены, но даже не могла представить себе какие.

Алтай перевернул мою жизнь. Усилил все происходящие во мне изменения в 10 раз. Целительница Анна работала со мной на всех уровнях. Она целила мое тело с помощью трав, проводила очищающие процедуры, восстанавливала баланс организма, поправляла иммунную систему. И в то же время целила мою душу при помощи звуков и танцев, что было мне очень понятно и близко, потому что я, будучи психотерапевтом, сама нередко применяла танцевально-двигательную терапию. Она оказалась очень мощным целителем с присущим в определенной мере даром ясновидения.

Также она работала со мной на уровне духовности, помогала отцепиться от этого генетического родового сценария, в котором мы умираем от рака. Две мои бабушки умерли от рака, причем одна из них именно от рака щитовидки. А еще она помогала мне измениться внутренне, признавать свои отрицательные черты характера и исправлять их. Что уж говорить – это был удивительный процесс трансформации.

Помимо целительницы, меня прокачивала сама природа. С одной стороны, Алтай – это бесконечные красоты, это километры прекрасного чистого серебристого снега, но с другой стороны, находиться там – огромное испытание.

К примеру, у меня всегда был страх перед собаками. А в алтайской деревне, где мне приходилось гулять одной, обитали здоровенные собаки, у которых была смесь с волками. Многие из них находились на привязи, но некоторые нет. И я с большим трудом перемещалась по деревне, испытывая безумный страх и чувствуя учащенное сердцебиение. Во время этих прогулок я проводила с собой внутреннюю работу. Училась доверять ситуации и одновременно себе, понимая, что в нужный момент я использую все силы, чтобы защитить свою жизнь.

Удивительным образом после такого опыта у меня напрочь прошел страх собак. И это только одна из произошедших со мной на Алтае чудеснейших перемен.

Спустя два месяца мне пришлось вернуться в Баку, учитывая законы, по которым граждане Азербайджана не могут проводить в России неограниченное количество времени. Однако мы договорились с Анной, что я обязательно вернусь.

Приехав домой, я почувствовала, что меня накрыло. Это был настоящий кризис, в котором смешалось все сразу. Но я ушла в работу над собой и в скором времени пришла в себя. Это случилось как раз накануне сдачи анализов. Я направлялась в клинику и понимала, что стала гораздо сильнее.

Думаю, именно это и повлияло на результаты анализов. Все врачи были настроены на отрицательный результат. И тут происходит чудо. Мне говорят, что организм начал отлично справляться, и облучение делать не нужно! Чтобы человеку с третьей стадией рака не сделали облучение – это практически нонсенс (улыбается).

«Рак не должен становиться центром жизни»

Когда-то давно я начала писать книгу в художественном жанре, но процесс никак не продвигался в силу нехватки времени. Сейчас же эта книга близится к завершению. Моя целительница Анна почувствовала, что я пишу книгу, и пророчила мне, что она выйдет большим тиражом и станет очень популярной. Но я не хочу загадывать об этом наперед.

Параллельно я начала писать другую книгу – о своей болезни, ощущениях и переживаниях. Также я собираю истории других онкологических больных. В процессе этого я познакомилась с огромным количеством людей, которые даже будучи на четвертой стадии рака исцелились. Все эти истории войдут в мою книгу о раке – сокровище, которое досталось мне в неприглядной обертке и вывело на путь служения.

Также у меня в последнее время возникло очень много других неожиданных интересов и желаний. Например, в этом году мне очень хочется позвонить в церковный колокол – я пока не знаю где и как, но чувствую в этом большую потребность. Еще я подумываю о том, чтобы стать лицом какой-нибудь косметической компании. И может даже удастся исполнить свою давнюю мечту – сняться в кино (улыбается).

И, наконец, мне хочется реализовывать социальные проекты. Идей в этом плане у меня много. Можно совместно с YARAT провести показ мод для женщин размера плюс-сайз. Или объединить усилия с местными фотографами и создать фотопроект, который помог бы людям принять себя и окружающий мир.

Есть еще одно важное пожелание – это влюбиться. Хотя, возможно, я уже… (улыбается)

В завершение я хочу донести до людей две важные мысли – жизнь должна протекать во всей своей полноте, даже если вы больны раком. Я продолжаю испытывать родительские, дружеские, профессиональные, любовные и сексуальные чувства, и моя жизнь остается насыщенной. Конечно, здесь все зависит от самочувствия человека. Но рак не должен становится основным фокусом. Ему надо уделять внимание ровно столько, сколько требуется. А дальше – просто жить.

И вторая важная мысль: для каждого человека рак – это своя история. Лично для меня он стал подарком. Но однозначно для всех людей рак – это путь, который ведет к очень глубоким переменам. Требование этого пути – измениться, и человек выбирает сам, меняться ему или оставаться прежним.

Лейла Мамедова

Фото: Надир Ибрагимли, личный архив Эллады Гориной

Как не приучать ребёнка к рукам | Наши Дети

A заодно к любви, поддержке и самостоятельности


Автор: Эллада Горина, психолог-консультант, псикоуч, специалист по перинатальной, телесной и арт-терапии

Как не приучать ребёнка к рукам (а заодно к любви, поддержке и самостоятельности)

Давно вы лежали на спине, беспомощный, напуганный и беспокойный, не управляя движениями рук и ног? Вы ещё слишком малы, чтобы заявить о себе и просить помощи иначе, чем криком. Но ваш плач остаётся гласом в пустыне – вы лежите один. Вас так воспитывают.

Дорогие взрослые, шепну вам на ушко:

— Если не желаете, чтобы ваш малыш вырос крепким и здоровым, имел устойчивую нервную систему – не берите его на руки.

— Если не хотите, чтобы у него вырабатывался в достатке гормон роста – не берите на руки.

— Если надеетесь прекратить кормление грудью как можно раньше – не берите на руки.

— Считаете, у новорождённого нет нужды в уверенности, что его любят? В ощущении безопасности и надёжного тыла в кольце тёплых объятий? Нет необходимости естественно обучаться эмоциональной и физической привязанности? Тогда отказывайте ему в руках, не укачивайте и как можно чаще оставляйте одного в кроватке.

Часто за сомнением, брать или не брать ребёнка на руки по первому требованию, стоит банальное незнание этапов детского развития.

Приучение к рукам – миф. Пребывание на руках — природное право. Вспомните животный мир – где это видано, чтобы требующему внимания детёнышу в нём отказывалось? По многу дней и месяцев матери носят их на себе или в зубах, держат постоянно под боком, пока детёныши не подадут сигнал, что готовы к раздельному существованию.

Телесный контакт – базовая потребность. Это спасение от страха, беспомощности, угрозы непривычного пока мира. Это исцеление от телесного дискомфорта — спазмов в животике и головных болей. Да, у некоторых новорожденных болит голова!

Брать на руки часто — это о будущей уверенности, самостоятельности, ощущении ценности себя.

Самое первое чувство, с которым ребёнок знакомится в утробе матери – осязание. Благодаря внутриутробным прикосновениям он успокаивается, изучает окружающий мир, его мозг активно развивается. Те же процессы продолжаются и после рождения. Контакт «кожи к коже» стимулирует в организме младенца выработку соматотропина – гормона роста и других обменных процессов.

Из древних традиций пестования пришла к нам фраза: ребёнка вынашивают восемнадцать месяцев — девять месяцев в утробе и девять месяцев на руках.

Для новорожденного малыша контакт с руками родителей жизненно необходим. Волноваться о будущей самостоятельности нет причин – с возрастом ситуация меняется: с ребёнком шести-девяти месяцев алгоритм взаимодействия уже другой, появляются новые правила общения.Я регулярно провожу группы психологической поддержки для молодых матерей. На занятиях женщины делятся опытом, как пережить нелёгкие первые месяцы. Как справляться с домашними делами и усталостью, когда малыш постоянно просится на руки.

Некоторые мамы упрощают быт и без сожаления откладывают дела, чтобы по первому крику подхватить на руки сына или дочь. Другие находят выход в использовании слинга. Кому-то удобнее прибегнуть к помощи родни или домработницы. Верная расстановка приоритетов плюс немного креативности – и процесс ношения ребёнка на руках перестаёт восприниматься как каторга.

Следуйте за внутренним откликом на младенческий призыв и обязательно отыщете способ организовать жизнь по-новому на ближайшие полгода.И берегите ребёнка от сравнений. Ваш малыш и малыш соседки различаются не только внешне, но и работой нервной системы, запасом стрессоустойчивости, эмоциональными запросам. Поэтому, одному необходимо немало времени проводить на руках, другому достаточно нескольких минут в час.Сколько слов ни скажи, ни напиши – ими не объяснить телесного опыта.

Предлагаю совместный эксперимент: прямо сейчас ложитесь на пол и представьте, что не управляете собственным телом. Вы не в состоянии переворачиваться, ползти, даже сдвинуться с места не в силах, конечности движутся хаотично и не подчиняются. Неуютно, тревожно, хочется тепла и прикосновений. Вам нужно, чтобы о вас позаботились. Нужны руки, в которых вы блаженно уснете.Время идёт, а рук все нет. Что вы чувствуете? Отчаяние, страх? Боль и дискомфорт? Или, так и не дождавшись, разочарование и апатию?

Это всего лишь эксперимент и вы взрослый человек. Представьте, что же тогда творится с чувствами и телом вашего ребёнка.

В самом раннем детстве ребёнок усваивает материнский и семейный посыл, а в дальнейшем переносит его на весь мир. Так пусть мамины руки, руки отца и других родных сообщают ему: мы ждали тебя, ты наша драгоценность. Мы согреем, накормим, не дадим в обиду. Мы защитим и поможем справиться с трудностями жизни. Ты в безопасности. Ты любим.

Однажды ваш ребёнок наестся и, сытый любовью, уверенный и самостоятельный, уйдёт, покорять огромный мир. А пока – держите его крепко и близко к сердцу.

#153 Эллада Горина: как загадывать такие желания, чтобы точно сбывались |

«Желание — это мой орган чувств. Через него я понимаю, что мне нужно взять в этом мире, что запустить внутрь себя, что выпустить в мир. Это как у пчёлок, которые берут нектар и выпускают мёд, прополис и маточное молочко. Люди делают точно так же. Желания — это механизм, через который мир говорит с нами», — уверена бизнес-мозгоправ клуба Websarafan Эллада Горина.

Кажется, ешё немного и мир переполнится планами, ожиданиями, мечтаниями и резолюциями. А хотите, чтобы все ваши желания точно сбылись? В этом подкасте мы поговорим о том, как это сделать легко, играючи, по-новогоднему. Будем вместе мечтать и учиться правильно загадывать желания.

Разобраться, как формулировать мечты, транслировать их во Вселенную и сделать настоящую карту желаний нам поможет психолог Websarafan Эллада Горина. Она — настоящий эксперт по вопросам миссии, укротитель прокрастинации и ловец самосаботажа. Эллада ведёт психологическую практику уже 17 лет и скопила просто огромную базу методик и работающих систем.

Кроме того к нам присоединятся наши любимые дуеры, участники бизнес-клуба Вебсарафана, которые расскажут, как они загадывают желания, и что из этого выходит. Да, этот выпуск тоже будет в новом для нас формате action-подкаста, когда мы не только учимся чему-то полезному у героя, но и показываем практические результаты.

На action-подкасте к нам присоединились:

Алина Алексанянц, детский психолог, психотерапевт. Около 30 лет работает с детьми, с 2000 года занимается частной практикой и готова помочь справиться с трудностями. Проекты Алины: детско-родительский групповой проект «Кукольные истории», экспресс-курс «Изучение особенностей взаимодействия в детско-родительской паре»

Лариса Магафурова — руководитель 1С: БухОбслуживание Умный бухучёт с 2010 года, автор и ведущая вебинаров о налоговой защите с 2014 года, руководитель и преподаватель онлайн-школы повышения квалификации бухгалтеров, руководитель онлайн-клуба «Академия Безопасности Налогоплательщиков», автор книги «Как руководителю проверить своего бухгалтера».

Помните о волшебных 72 часах? Ну так мы сократили это правило всего до часа подкаста. Слушайте наш предпраздничный и заряженный на новые свершения выпуск, и ваши желания обязательно сбудутся!

Конспект подкаста: http://blog.websarafan.ru/podcast153
Практикум Эллады Гориной: https://websarafan.ru/ellada-p

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Чем может быть опасен визит к гинекологу. — 2 ответов на Babyblog

Очень интересная статья, которая в принципе относится не только к гинекологам, а вообще к врачам и их работе с пациентами.

Текст: Светлана Шмидт

Сам по себе вопрос может показаться странным: как может быть опасен визит к врачу? Оказывается, еще как может. И гинекологи в плане опасности занимают одно из лидирующих мест.
В интернете был описан случай, как женщина 40 лет умерла от рака, вызванного болевым шоком. А вызвал это состояние гинеколог. Когда пациентку привезли в больницу с кровотечением, врачу необходимо был сделать чистку. Теперь трудно понять, по каким причинам, но сделал врач это «на живую», то есть, даже не обезболив женщину. Учитывая, что у пациентки из-за определенных проблем со здоровьем и так все болело нестерпимо, чистка принесла ей адские муки. Через несколько месяцев после этого у нее диагностировали рак, происхождение которого определили, как «возможное на фоне болевого шока».
Описанный случай, безусловно, редкий. Но время от времени подобные «всплывают» то во всемирной паутине, то на уровне обывательских разговоров. К сожалению, далеко не всегда они беспочвенны.
А начинается все с несоблюдения врачом элементарных правил этики. Председатель азербайджанского Общественного объединения по просвещению в области прав человека Ирада Джавадова рассказывает, что она практически ежедневно сталкивается с жалобами на нарушения врачами профессиональной этики. Грубость, пренебрежительное отношение к пациенткам, особенно молодым, у некоторых гинекологов становится обычной практикой.
Еще один азербайджанский врач Эллада Горина рассказывает, что в медицине есть явление, именуемое «ятрогенное заболевание» (психогенные расстройства). Болезнь возникает из-за грубых поступков, высказываний, намеков врачей, которые травмируют психику пациента, вызывая любые негативные эмоции: возмущение, гнев, обиду, унижение. Высказывания типа «Раньше надо было рожать», «Следите за мужем, чтобы не было потом вопросов», «Да ладно, не может это быть больно — неженка нашлась», или того хуже: «… а с мужиком спать было не больно? — теперь терпи» — могут вывести из равновесия какого угодно человека.
Кандидат медицинских наук, российский гинеколог Дмитрий Лубнин одной из опасностей визита к гинекологу называет запугивание пациенток несуществующими, либо несущественными заболеваниями. По его мнению, половину болезней, обнаруженных в ходе приема у гинеколога, лечить вообще не надо. Например, эрозия шейки матки лечится только в том случае, если она является причиной кровяных выделений. Во всех остальных случаях во всем мире ее считают обыденным явлением, не требующим вмешательства врачей, так как никакой опасности для здоровья она не представляет.
Так же как и уреаплазмы и микоплазмы. В своей книге «Честный разговор с российским гинекологом» Дмитрий Лубнин подробно поясняет, что названные микроорганизмы периодически живут в половых путях мужчин и женщин. Они никоим образом не воздействуют на организм, не приводят к бесплодию, выкидышу, другим осложнениям, однако врачи считают своим долгом «нагружать» пациентку тяжелыми антибиотиками в течение довольно продолжительного времени.
Еще одной проблемой визита не только к гинекологу, но и любому врачу, является навязывание доктором дорогих лекарств определенной фирмы. Но у женских врачей это получило наибольшее распространено. Особенно любят они рекомендовать очень дорогие контрацептивы. И дело не только в ущербе для кошелька. Очень часто подобные противозачаточные являются причиной возникновения целого ряда заболеваний.
Доктор медицинских наук Б. Глуховец и кандидат медицинских наук Н. Глуховец опубликовали работу, посвященную современным контрацептивам. Взяв за основу исследования репродуктивных органов у женщин, оперированных гинекологами, а также умерших женщин, принимавших внутриматочные и оральные контрацептивы, ученые пришли к выводу, что безопасность данных лекарств, несмотря на восторженные отзывы в рекламе, вызывает большие сомнения. Так, было установлено, что продолжительный прием синтетических половых гормонов здоровыми женщинами имеет исключительно отрицательное воздействие: на репродуктивную систему, гипоталамические центры, яичники, маточные трубы, влагалище, матку и даже молочные железы, включая образование мастита.
Добросовестные доктора предостерегают женщин еще от одной недопустимой для врачей привычки, патернализма. Это когда врач разговаривает с вами, как с неразумным ребенком. Его тон и поведение как бы говорят вам: слушай беспрекословно, я врач, я лучше знаю, а тебе вдаваться в подробности необязательно. При этом доктор может запросто перейти на «ты», тем самым еще более подчеркнув ваше зависимое положение. Современный кодекс профессиональной врачебной этики предусматривает партнерские отношения между доктором и пациентом. Последний должен быть хорошо проинформирован о характере заболевания и обо всех процессах, которые с ним происходят. Врач обязан интересоваться его мнением и даже в некоторых случаях советоваться с ним при принятии решения о дальнейших путях лечения.

Нарушение врачебной этики гинекологом: чем это опасно | Умная

Сам по себе вопрос может показаться странным: как может быть опасен визит к врачу? Оказывается, еще как может. И гинекологи в плане опасности занимают одно из лидирующих мест.

В интернете был описан случай, как женщина 40 лет умерла от рака, вызванного болевым шоком. А вызвал это состояние гинеколог. Когда пациентку привезли в больницу с кровотечением, врачу необходимо был сделать чистку. Теперь трудно понять, по каким причинам, но сделал врач это «наживую», то есть, даже не обезболив женщину. Учитывая, что у пациентки из-за определенных проблем со здоровьем и так все болело нестерпимо, чистка принесла ей адские муки. Через несколько месяцев после этого у нее диагностировали рак, происхождение которого определили, как «возможное на фоне болевого шока».

Описанный случай, безусловно, редкий. Но время от времени подобные «всплывают» то во всемирной паутине, то на уровне обывательских разговоров. К сожалению, далеко не всегда они беспочвенны.

А начинается все с несоблюдения врачом элементарных правил этики. Председатель азербайджанского Общественного объединения по просвещению в области прав человека Ирада Джавадова рассказывает, что она практически ежедневно сталкивается с жалобами на нарушения врачами профессиональной этики. Грубость, пренебрежительное отношение к пациенткам, особенно молодым, у некоторых гинекологов становится обычной практикой.

Еще один азербайджанский врач Эллада Горина рассказывает, что в медицине есть явление, именуемое «ятрогенное заболевание». Болезнь возникает из-за грубых поступков, высказываний, намеков врачей, которые травмируют психику пациента, вызывая любые негативные эмоции: возмущение, гнев, обиду, унижение. Высказывания типа «Раньше надо было рожать», «Следите за мужем, чтобы не было потом вопросов», «Да ладно, не может это быть больно – неженка нашлась», или того хуже: «… а с мужиком спать было не больно? – теперь терпи» – могут вывести из равновесия какого угодно человека.

Кандидат медицинских наук, российский гинеколог Дмитрий Лубнин одной из опасностей визита к гинекологу называет запугивание пациенток несуществующими, либо несущественными заболеваниями. По его мнению, половину болезней, обнаруженных в ходе приема у гинеколога, лечить вообще не надо. Например, эрозия шейки матки лечится только в том случае, если она является причиной кровяных выделений. Во всех остальных случаях во всем мире ее считают обыденным явлением, не требующим вмешательства врачей, так как никакой опасности для здоровья она не представляет.

Так же как и уреаплазмы и микоплазмы. В своей книге «Честный разговор с российским гинекологом» Дмитрий Лубнин подробно поясняет, что названные микроорганизмы периодически живут в половых путях мужчин и женщин. Они никоим образом не воздействуют на организм, не приводят к бесплодию, выкидышу, другим осложнениям, однако врачи считают своим долгом «нагружать» пациентку тяжелыми антибиотиками в течение довольно продолжительного времени.

Еще одной проблемой визита не только к гинекологу, но и любому врачу, является навязывание доктором дорогих лекарств определенной фирмы. Но у женских врачей это получило наибольшее распространено. Особенно любят они рекомендовать очень дорогие контрацептивы. И дело не только в ущербе для кошелька. Очень часто подобные противозачаточные являются причиной возникновения целого ряда заболеваний.

Доктор медицинских наук Б. Глуховец и кандидат медицинских наук Н. Глуховец опубликовали работу, посвященную современным контрацептивам. Взяв за основу исследования репродуктивных органов у женщин, оперированных гинекологами, а также умерших женщин, принимавших внутриматочные и оральные контрацептивы, ученые пришли к выводу, что безопасность данных лекарств, несмотря на восторженные отзывы в рекламе, вызывает большие сомнения. Так, было установлено, что продолжительный прием синтетических половых гормонов здоровыми женщинами имеет исключительно отрицательное воздействие: на репродуктивную систему, гипоталамические центры, яичники, маточные трубы, влагалище, матку и даже молочные железы, включая образование мастита.

Добросовестные доктора предостерегают женщин еще от одной недопустимой для врачей привычки, патернализма. Это когда врач разговаривает с вами, как с неразумным ребенком. Его тон и поведение как бы говорят вам: слушай беспрекословно, я врач, я лучше знаю, а тебе вдаваться в подробности необязательно. При этом доктор может запросто перейти на «ты», тем самым еще более подчеркнув ваше зависимое положение. Современный кодекс профессиональной врачебной этики предусматривает партнерские отношения между доктором и пациентом. Последний должен быть хорошо проинформирован о характере заболевания и обо всех процессах, которые с ним происходят. Врач обязан интересоваться его мнением и даже в некоторых случаях советоваться с ним при принятии решения о дальнейших путях лечения.

«Что покажет простыня». Как древние свадебные традиции Кавказа преследуют современных женщин

  • Магеррам Зейналов
  • Би-би-си

Свадьба — для многих одно из самых счастливых событий в жизни — часто становится кошмаром для женщин в странах с сильными патриархальными традициями. В Азербайджане, где до сих пор распространены браки по решению родителей, древние обычаи превращают этот день в психическую и физическую пытку невесты, последствия которой могут ощущаться годами.

«Когда после свадьбы он начал передо мной раздеваться, я испугалась, — вспоминает свою первую брачную ночь Эльмира (имя изменено по просьбе героини). — И сколько бы я ни думала о том, что я уже замужем и это должно произойти, меня это нисколько не успокаивало — я только знала, что прямо сейчас тоже должна раздеться».

На тот момент Эльмире было 27 лет, она закончила университет и работала переводчиком. Мужа ей подобрали родители. Выйти за него замуж она согласилась, чтобы «порадовать мать». «Он был просто нашим соседом, мы были с ним разных взглядов, он был без образования, у нас не было ничего общего, — вспоминает она. — С ним меня познакомили мои братья и сказали, что, мол, хороший парень. Мама же была счастлива, что, выйдя за соседа, я буду у нее все время на виду».

Несколько раз Эльмира говорила матери, что не хочет сейчас создавать семью. Мать рассказала об этом родственникам, и те стали давить на нее. «А мне было уже 27, и они начали подозревать, что вдруг я не девственница, раз замуж не хочу», — говорит она.

Но секс в первую брачную ночь был для Эльмиры первым. Зная это, муж совершенно не интересовался ее самочувствием, рассказывает она. Он просто навалился на нее, а когда ее голова начала биться о шкаф, из соседней комнаты послышался стук и женский окрик: «Эй, потише там, что за бескультурье!»

За дверью в этот момент сидели мать Эльмиры, две тети, свекровь и еще одна дальняя родственница (та, что стучалась и кричала) — люди, традиционно необходимые для заверения «акта любви» и девственности невесты.

«Слышен был любой звук, — вспоминает Эльмира. — Я же вся тряслась от боли и стыда и думала, неужели это и есть брак».

Та самая дальняя родственница исполняла роль «енги» — замужней женщины, которая сразу после свадьбы отправляется домой к молодоженам, чтобы всю ночь просидеть в соседней комнате. Одна из ее обязанностей — консультации, поскольку считается, что невеста априори несведуща в сексе, и поэтому имеет право выбежать из спальни, чтобы спросить совета у старшей и опытной женщины.

Другая обязанность енги — забрать простыню с кровати новобрачных.

«Брачная ночь окутана мистикой»

Демонстрация постельного белья наутро после свадьбы — традиция, характерная для многих народов Кавказа. Следы крови на ней служат для родственников подтверждением сексуальной связи. Увидев такие «доказательства», родственники поздравляют новобрачных, и лишь после этого брак считается действительно состоявшимся.

«Таким образом, брачная ночь часто окутана мистикой — мол, что покажет наутро простыня, — говорит Шахла Исмаил, исследователь в области прав женщин в Азербайджане. — И когда наутро простыню показывают родственникам, все считают своим долгом прокомментировать увиденное».

Если крови на простыне нет, девушку могут выгнать, вернуть родителям как «бракованную». После этого она считается «разведенкой» — зачастую ей трудно снова выйти замуж, а в родительском доме ее могут травить.

Азербайджанские правозащитники говорят, что традиция свидетелей первой брачной ночи и предъявления простыни распространена в основном за пределами крупных городов.

Иногда перед свадьбой девушку проверяют на девственность у «специалистов» — с помощью гинекологической процедуры, эффективность которой ставится под сомнение ведущими международными организациями. Осенью прошлого года ООН и ВОЗ призвали прекратить эту практику, которая сохраняется по меньшей мере в 20 странах мира, назвав ее травматичной и унизительной для женщин. Как отмечается в заявлении, понятие девственности отсутствует в медицине и представляет собой лишь социальную, культурную и религиозную концепцию.

«Ужас перекрывал любой стыд»

Для Эльмиры чувства, связанные с первой брачной ночью, — это страх, боль и стыд. Она слышала, как за дверью включают и выключают свет, как наливают чай; она знала, что их с мужем в другой комнате тоже слышат. «Я была не в себе и просто боялась что-то сказать, — вспоминает она. — Я не спала всю ночь, а ему было все равно, так что он спокойно уснул».

Утром «свидетели» зашли в спальню, чтобы забрать простыню. «К тому времени мне было уже все равно, умом я понимала, как это все мерзко, но то, что произошло ночью, этот ужас, он перекрывал любой стыд, — говорит Эльмира. — Когда женщина рожает, ей все равно, гинеколог мужчина или женщина. Так и здесь — я знала, что все будут рассматривать эту простыню, но у меня был такой шок, что я даже плохо помню, как ее забрали».

Традиция свидетелей и простыни с годами становится все более травматичной для женщин, отмечает психолог Эллада Горина. В современном мире, где все больше людей женятся позже и к моменту вступления в брак, как правило, уже имеют представление о сексе, сидящим в соседней комнате родственникам уже не нужно консультировать молодоженов, и их роль сводится к верификации девственности невесты.

«До сих пор для многих женщин енгя — это норма. В их картине мира это не хорошо и не плохо, в мире, где они родились и выросли, по-другому не было, — говорит Горина. — Травматизация, конфликт и переживания происходят тогда, когда новые поколения людей развиваются в условиях большего просвещения [чем их родители]».

Нигяр, жившая раньше на севере Азербайджана, вспоминает, что во время ее брачной ночи «консультантов» в соседнюю комнату набилось не один и не два, а «вся деревня». «Мне никогда не было так стыдно, но я думала, что раз так принято, наверное, старшие лучше разбираются», — рассказывает она.

По словам Нигяр, ни у нее, ни у мужа не было никакого желания заниматься сексом, потому что они слышали, как за дверью «сидят, двигают стулья, дышат». Наутро им тоже надо было предъявить простыню.

Тогда Нигяр было 18, сейчас ей чуть за 30, она разведена, живет в Баку, а родственников называет «извращенцами».

Однако не всем удается начать новую жизнь, и из-за положения женщины в патриархальных обществах изменить устоявшиеся порядки очень тяжело. «Бывает, что женщина с мужем говорит об этом [о брачной ночи], бывает, что боится даже открыть рот, и надеется, что муж начнет вести себя по-другому, — говорит Эллада Горина. — Тут мы уже выходим на тему неравноправия полов, когда женщины находятся в угнетенном состоянии».

«Красное яблоко»

Связанная с простыней традиция есть в Армении, Азербайджане, иногда встречается в Грузии и некоторых республиках Северного Кавказа.

Армянский обычай похож на азербайджанский, разве что нет свидетелей за дверью. Он называется «красное яблоко» — деликатная отсылка к следам крови на белье. Традиция здесь также соблюдается в основном за пределами Еревана. «Чем дальше от столицы, тем «больнее пациент» и тем больше сопротивление, местами доходящее до фанатизма», — говорит Нина Карапетянц, председатель Хельсинкской ассоциации по правам человека в Армении.

Она вспоминает случаи, когда наутро после первой брачной ночи родственницы с соседками приходили к новобрачным в спальню проверять простыню, а затем отправляли в дом невесты корзины с красными яблоками и подарками. После этого родные невесты могли пригласить своих родственников и соседей и доказать, что их дочь «чиста и целомудренна». «Таким образом, полгорода, а в деревнях и вся деревня, принимали участие в ритуале унижения», — говорит Карапетянц.

В деревнях зачастую девушек выдают замуж, как только им исполняется 18 лет, и у многих нет ни специальности, ни работы. Если такая девушка не пройдет «яблочный тест», родители могут от нее отказаться.

35-летняя Ани (имя изменено по просьбе героини) познакомилась со своим будущим мужем на вечеринке, когда им было чуть за 20. Несмотря на то, что у обоих есть высшее образование, они живут в Ереване и женились по любви, они отказывали себе в сексе до свадьбы — чтобы не вызывать вопросов у консервативных родственников.

«Я сидела, завтракала на кухне — пришла свекровь и женщины со стороны мужа, тетки, бабульки и пара близких соседей, — вспоминает она утро после свадьбы. — Так и сидела в другой комнате, пока «делегация» делала проверку». По словам Ани, в то утро она скорее чувствовала облегчение, потому что теперь может жить своей жизнью, не боясь сплетен за спиной.

«Не вспоминали ту ночь»

По словам психолога Эллады Гориной, если некоторые переживают этот опыт относительно легко, то для других травма может растянуться на годы. «Был случай, когда человек пришел с другой проблемой, но оказалось, что [после первой брачной ночи] не было крови, и среди ночи ее всей семьей мужа повезли к врачу проверять, девственница она или нет», — вспоминает психолог. По ее словам, подобное вторжение в личное пространство заставляет женщину чувствовать себя жертвой насилия, с последствиями которого она потом долго не может справиться.

Через полгода после свадьбы муж Эльмиры умер. «Все полгода мы не вспоминали ту ночь», — говорит она.

После смерти мужа мужчин у нее больше не было — по ее словам, из-за психологического барьера. «Я даже готова была бы и замуж выйти или завести отношения, но мой прошлый опыт меня останавливает», — говорит она.

У Эльмиры есть десятилетний сын, с которым она разговаривает на тему секса и рассказывает, как устроено женское тело. «Я ему скажу — веди себя по-человечески, а если будет когда-нибудь дочь, скажу ей — не совершай моих ошибок», — обещает она себе.

«Сейчас, окажись я теперешняя в той ситуации, я бы с ним (мужем — Би-би-си) и с тетками по-другому себя вела», — говорит Эльмира.

Эксперты из Армении и Азербайджана сходятся в том, что эти традиции хоть и медленно, но уходят в прошлое. «Новое поколение готово к борьбе за свои права», — говорит армянская правозащитница Нина Карапетянц. «Я знаю семьи, которые отказались от церемонии, — отмечает азербайджанская исследовательница Шахла Исмаил. — Я считаю, что эти люди смельчаки, с них начинаются изменения». По словам грузинских правозащитников, в их стране обычай с простыней уже практически не встречается.

***

Еще 30 лет назад свадьбы праздновали дома, в ресторане или в большой палатке на улице. Сегодня даже бедные семьи идут для этого в специальные «дома торжеств», выросшие в годы независимости во всех городах.

В одном из таких домов в пригороде Сумгаита отмечают свадьбу Ариф и Малейка (имена изменены) — молодые люди из небогатых семей, которых познакомили родственники. По традиции, жених и невеста сидят отдельно — на возвышении, за единственным столом без спиртного. Как с пьедестала, они наблюдают за тем, как танцуют и веселятся их гости — почти 400 человек. Никто не кричит «горько», жених не целует невесту — при всех не принято.

Однако с положенным ей скромным неулыбчивым видом Малейка просидела недолго — под изумленные взгляды родственников она тоже вышла танцевать. Гости шептались и сплетничали, называли Малейку нахалкой и бесстыжей. «Это разве дискотека!» — возмущалась одна. «Как можно быть такой нескромной, она же не уважает традиции», — сетовала другая. Гостям не нравилось, что невеста не уделяла должного внимания им всем, что предпочитала общаться с друзьями, а не родственниками, что командовала мужем.

Но в финале традиция добралась и до новобрачных. Когда их машина отъехала от дома торжеств, за ними вслед отправилась другая, в которой сидели четыре подвыпившие женщины.

Иллюстрации Магеррама Зейналова

Kultura.az

 

Взгляд в окно, в боковое зеркальце, на руль и — по газам! Машина мчится по дороге, плавно поводящей боками поворотов, в Новханы, мимо нефтяных качалок и Масазырского соляного озера розоватого отлива.

Девчонка, что сидит в его машине смеется глуповато, легко и заливисто. Глазеет на себя в зеркальце, довольно надувает губки, впечатленная собственной внешностью и вся в предвкушении удовольствий предстоящего дня. И время от времени подпевает песенке, сама под стать этой мелодии – такая же веселая, легкая, зажигательная, модная, с претензией на многое, но c реальным ресурсом — месяца три, максимум, продержаться в топе фаворитов, а потом как-то сразу сильно приедающаяся, набивающая оскомину до судорог в скулах. И тотчас сменяющаяся новой, почти такой же, с небольшим отличием в ритме и аранжировке.

Конечно же, ему прекрасно известно, что этот «ритм», восседающий на переднем пассажирском сиденье машины, несущейся по трассе посреди великолепного июня, уже к началу осени «оттыцает и отбумцает» свое и сменится другим.

Он простится с девчонкой неожиданно и безболезненно, почти сразу позабудет все ее запахи и звуки. Все будет в точности так же, как и с этой наигрывающей в динамиках песенкой. А есличерез энное количество лет и придется снова услышать этот мотивчик, либо кто-то случайно напомнит о нем во «вспоминательной» беседе, то ему вздохнется ностальгически, мол, да, да, милая была музыка, хорошие времена и, возможно, в душе шевельнутся остаточки-пленочки воспоминаний, приятные даже, но быстро улетучивающиеся как эфирное масло с донышка сосуда при его нечаянной раскупорке или как мысли о зиме в разгар пляжного сезона.

Да, она исчезнет из его жизни, но расставание неизбежно повлечет за собой появление других, тоже класса Inna — «Amazing», Инфинити — «Слезы-вода», Dj Smash- «Между Небом и Землей».

Пару раз ему подфартит на кого-то вида «Satisfaction» Бенни Бенасси, цыпочки подобные Pitbullевским не станут прятать взгляда в пол и подпоют «I know you want me», да и местная Гага неминуемо приворожит его разок. Эти встречи заденут чувственно-плотские стороны его натуры больше чем прочие, но и это быстро высохнет…

Несомнеееенно, несомненно, ему на жизненном пути, а именно на этажах разномастных офисов, на тусовках и концертах-шоу повстречаются девушки семейства «Meet me halfway» Black eyed peas и «Take on me» a-ha. Но здесь он, искусно создавая видимость прозрачной искренности и открытого общения, станет флиртовать с ними предельно аккуратно, на уровне «привет_какздорововыглядишь_пока», дабы не развивать тему и не запускать несколько первых прозвучавших нот в целую композицию. А все потому что.. потому что так и все, точка!

Наверняка, он в достаточно обозримом будущем женится. Такая возможность не казалась ему близкой, стремительно надвигающейся, но в перспективе казалось приятным заполучить спокойную идиллию семейной жизни. Чаще всего всплывающей картинкой-образом была следующая — дачный сад, щекочущие усики виноградника, крепкий чай в хрустальных стаканах на столе, он беседует с друзьями, его малые детки носятся среди деревьев. И здесь же, неподалеку, — жена, присутствует как будто рядом, и в то же время сама по себе, не требует с него бесконечного, заостренного на ее персоне, внимания. Она будет сродни мировому хиту, наподобие «Besame mucho» сеньориты Торрес или «Ностальжи» Иглесиаса-старшего. Мелодии, красоту, проникновенность и богатство высказанного и невысказанного в которых признаешь, пусть даже они не цепляют тебя самого до глубины души. Это та мелодия, что быть может не вызовет бурю сильнейшего волнения души и плоти, но более чем благоприятна и притягательна в качестве тихого, уживчивого и ненавязчивого фона. Порой она может поднадоесть, но иногда, совсем напротив, в ней расслышишь какой-то особый напев, словно неожиданно раскроются тебе чаяния сочинивших и исполнивших ее, и захочется прослушать снова и снова, чтобы стать ближе…

Впрочем, все это дело будущего, пока же он несется по летней трассе, обдуваемый пыльно-нефтяным ветерком, под щебет своей нынешней милашки. Их ждут его друзья-товарищи разной степени продолжительности и глубины дружественности. Друзья, ассоциирующиеся у него кто с ритмами жизнеутверждения Боба Марли, кто с изогнуто-долгими мугамами Алима Гасымова, кто с особым дворовым шансоном Боки, кто с буддистскими подвываниями.

Лучшим среди них был тот, что звучал подобно «Мой друг» Арии, проповедовал тоже, что и несравненный Майкл Джексон их детства в «Black or White» и почти канонизированный Леннон молодости их родителей в «Imagine». Но теперь того друга уже нет ни с ним, ни с кем другим, во всяком случае на этой земле…

Всей шумной компанией они станут кутить да веселиться, а над их головами будет стоять тихий гул мелодий каждого из них, послевкусие которых он увезет с собой.

Так и пройдет лето — тусовки, работа, веселая подружка с легким для запоминания и для забывания именем; пара свадеб с отштампованными-отшлифованными, от зубов отскакивающими вопросами-ответами и обязательными образцово-показательными поцелуями и объятиями родственников. Родственников, что общей линией звучат сольным концертом Назпери Досталиевой с переходом в хиты Айгюн Кязимовой, местами заходятся Аллегровой с Крутым и их хрустальным бокалом в поколении среднего возраста, и неким синтезом между Дискотекой Авария, Коламбия пикчерс и Рианной — в младшем поколении. Но к большинству всей этой массы как нельзя лучше лепится фраза «If you wanna be rich, you’ve got to be a bitch» из «White horse» Тейлор Свифт.

Да, так пройдет лето. Наступит осень. И в некий неясно_с_чего_вдруг_момент, он, как это уже бывало не раз, неожиданно для себя и всех прочих зароется подслеповатым кротом в спасительной темноте своей норы, законопатится от всего мира и, сидя прямо на полу, со взъерошенными волосами и в расстегнутой рубашке, станет слушать The Unforgiven 2…

Чтобы вспоминать именно ту,

Что и есть та самая анфогивен ту…

Вспоминать со всей силой боли, недопрожитой и заваленной валунами времени, событий, людей, со всей силой ярости, горя и непрощения, и снова становиться несвободным от той, что была Aerosmithовскими «Сrazy» и «I Don’t Want To Miss», была «You» Тена Шарпа, океанэльзовской «Така, як ти» в его жизни, но оставила лишь душащий пепел The Unforgiven 2 и свободу…

Эллада Горина

http://tamganet.com/

Somos Músicos | сообщество музыкантов @ Школа музыки Техасского государственного университета

Президент Американской ассоциации латиноамериканцев в сфере высшего образования объявил, что профессор музыки TXST Джон Лопес будет лауреатом премии Уильяма Агилара в области культурного искусства 2019 года. Эта награда «присуждается лицам, которые внесли значительный вклад в понимание национального латиноамериканского сообщества и / или культуры посредством изобразительного, творческого и исполнительского искусства.”

Джон Лопес был восходящей звездой Техасского государственного университета с тех пор, как окончил университет по специальности «музыка», получил здесь степень магистра музыки в 1992 году, преподавал на полставки, затем на полную ставку, а затем стал штатным доцентом. . Он основал и координировал направление латиноамериканских музыкальных исследований в Университете штата Техас в 2003 году.

Начиная с создания Salsa del Rio в 1995 году, территория расширилась за счет таких отмеченных наградами ансамблей, как Mariachi Nueva Generacion, Mariachi Lince De Oro и Orquesta del Rio.Под руководством Лопеса ансамбли сальсы и мариачи получили широкое признание во всем штате, а также на национальном и международном уровнях благодаря нескольким возможностям выступлений. Salsa del Rio выступала на джазовом фестивале в Монтрё, джазовом фестивале в Бриенце, Карнавале в Ницце, Канкуне и Мехико, а также на престижном джазовом фестивале Нотр-Дам, где они выиграли несколько наград.

Mariachi Nueva Generacion стал одним из лучших университетских ансамблей Мариачи в штате Техас.Они регулярно соревнуются в Mariachi Vargas Extravaganza, ежегодно проводимом в декабре в Сан-Антонио, штат Техас, где они занимали первые восемь мест из последних одиннадцати лет, в течение которых они соревновались. На международном уровне Mariachi Nueva Generacion гастролировала по Европе вместе с Симфоническим оркестром Техасского государственного университета. В 2012 году Mariachi Nueva Generacion и Salsa del Rio гастролировали и выступали в Чили.

важность для регуляции генов, участвующих в остановке клеточного цикла и апоптоза

Biochem J.2005 15 июля; 389 (Pt 2): 443–455.

Джордж Куцодонтис

* Департамент фундаментальных наук Медицинской школы Университета Крита, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

Элефтерия Василаки

* Департамент фундаментальных наук Медицинской школы Университета Крита, Ираклион, Крит, GR -71110, Греция

Ван-Чих Чоу

* Департамент фундаментальных наук Медицинской школы Университета Крита, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

Параскеви Папакоста

* Департамент фундаментальных наук Медицинской школы Университета Крита , Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

Димитрис Кардассис

* Департамент фундаментальных наук, Медицинская школа Университета Крита, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

† Институт молекулярной биологии и биотехнологии, Фонд исследований и технологии Эллады, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

* Департамент фундаментальных наук, Медицинская школа Университета Крита, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция 900 05

† Институт молекулярной биологии и биотехнологии, Фонд исследований и технологий Эллады, Ираклион, Крит, GR-71110, Греция

1 Текущий адрес: Novartis Pharma GmbH, Brunner Strasse 59, A-1235 Vienna, Austria.

Поступило 29 ноября 2004 г .; Пересмотрено 14 марта 2005 г .; Принято к печати 24 марта 2005 г.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

В настоящем исследовании мы исследовали механизмы транскрипционного взаимодействия между белками, принадлежащими к семействам факторов транскрипции супрессоров опухолей p53 и Sp (специфичность белков). Такие механизмы могут играть важную роль в регуляции генов, содержащих сайты связывания для обоих классов факторов транскрипции в их промоторах.В настоящем исследовании были проанализированы два из этих генов: ген ингибитора циклин-зависимой киназы p21 Cip1 и ген PUMA (медиатор апоптоза, регулируемый p53). Мы обнаружили, что Sp1 и Sp3, но не Sp2, функционально взаимодействуют с p53, p73 и p63 для синергетической трансактивации промотора p21 Cip1 в клетках Drosophila Schneider SL2, в которых отсутствуют эндогенные факторы Sp. Мы также обнаружили, что Sp1 сильно трансактивировал промотор PUMA синергетически с p53, тогда как делеция сайтов связывания Sp1 отменяла трансактивацию с помощью p53.Используя мутантные формы p53 в анализах GST (глутатион-S-трансферазы), мы обнаружили, что С-концевые 101 аминокислоты p53, которые включают олигомеризацию и регуляторные домены белка, необходимы для физических взаимодействий с Sp1 и Sp3, и эта делеция этой области аннулировала трансактивацию промотора p21 Cip1 . Используя усеченные формы Sp1, мы установили, что p53 взаимодействует с двумя доменами трансактивации A и B, а также с ДНК-связывающим доменом.Наши результаты показывают, что факторы Sp необходимы для клеточных реакций на активацию p53 генотоксическим стрессом. Подробное понимание того, как члены семейств факторов транскрипции p53 и Sp взаимодействуют и работают вместе в клеточных ответах, опосредованных p53, может открыть новые горизонты в химиотерапии рака.

Ключевые слова: апоптоз, клеточный цикл, p21, p53, медиатор апоптоза, регулируемый p53 (PUMA), белок специфичности 1 (Sp1)

Сокращения: ChIP, иммунопреципитация хроматина; DBD, ДНК-связывающий домен; DMEM, среда Игла, модифицированная Дульбекко; EMSA, анализ изменения электрофоретической подвижности; 5-ФУ, 5-фторурацил; GST, глутатион-S-трансфераза; HEK, эмбриональная почка человека; HRP, пероксидаза хрена; IPTG, изопропил-β-D-тиогалактозид; Ni-NTA, Ni 2+ -нитрилотриацетат; NP40, Nonidet P40; ONPG, или -нитрофенил-β-D-галактопиранозид; PUMA, медиатор апоптоза с регулируемой активностью p53; Rb, белок ретинобластомы; SAM, стерильный альфа-мотив; Sp — белок специфичности; TAD, домен трансактивации; TnT, транскрипция и трансляция

ВВЕДЕНИЕ

p53 — это специфичный для последовательности фактор транскрипции, который усиливает экспрессию большого количества генов, продукты которых необходимы для развития клеточного цикла, дифференцировки, репарации ДНК и апоптоза [1–3].p53 кодируется одним из наиболее часто мутирующих генов при различных формах спорадических и наследственных видов рака [1,3]. У мышей, у которых ген р53 был инактивирован путем гомологичной рекомбинации, в молодом возрасте развились спонтанные опухоли, что позволило установить опухолевые супрессивные функции этого белка [4].

p53 можно структурно и функционально разделить на три области: N-концевую область, которая содержит кислый TAD (домен трансактивации) между аминокислотами 20 и 60, центральную область, которая несет специфичный для последовательности DBD (ДНК-связывающий домен) между аминокислотами 102 и 292 и С-концевой областью, которая несет домен тетрамеризации между аминокислотами 324 и 355 [2].Две дополнительные области p53, которые играют функциональные роли, — это богатый пролином домен (остатки 60–90), который содержит пять копий мотива PXXP (Src homology 3) и играет роль в апоптозе [5,6], и C- терминальная основная область между аминокислотами 367 и 393, которая может влиять на ДНК-связывающую функцию центральной области белка р53 за счет стерических или аллостерических взаимодействий и способствует распознаванию форм ДНК, которые напоминают участки повреждения ДНК [7–9]. Тетрамерный белок p53 (который представляет собой димер двух димеров) связывается с четырьмя разными повторами консенсусной последовательности ДНК 5′-RRRC (A / T) -3 ‘(где R — пурин), когда эта последовательность повторяется в двух парах. , каждый из которых расположен в виде перевернутого повтора [10].Большинство человеческих опухолевых мутаций в p53, которые были охарактеризованы на сегодняшний день, локализованы в DBD и C-концевой основной области белка [3].

Агенты, вызывающие повреждение ДНК, такие как УФ-излучение, гипоксия или определенные канцерогены, активируют p53, индуцируя его фосфорилирование по определенным сериновым остаткам, что приводит к диссоциации белка MDM2 (мышиная двойная минута 2) и последующей стабилизации p53 [11 ]. Активность p53 также регулируется пептидил-пролилизомеразой Pin1, которая связывается с фосфо-сериновыми / пролиновыми мотивами на p53 и изомеризует пептидную связь, образованную между фосфорилированным серином и соседним остатком пролина [12,13].

p53 принадлежит к семейству факторов транскрипции, которое также включает гомологичные белки p63 и p73, структуры и функции которых подобны, но не идентичны p53 (C) [14,15]. Большинство консервативных остатков в p53, p63 и p73 кластеризованы в TAD, DBD и домен олигомеризации [16–18]. Однако p63 и p73 содержат удлиненные C-концы с определенными функциями, включая второй TAD [19], а также SAM (стерильный альфа-мотив), который участвует во взаимодействиях белок-белок [20,21].Различные С-концы p63 и p73 образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК [15].

Транскрипционный синергизм между членами семейства Sp и p53 регулирует активность промотора p21 Cip1 человека

( A ) Схематическое изображение репортерной конструкции p21 Cip1 (-2325 / + 8) p21-Luc, которая была используется в экспериментах по трансактивации на этом и последующих рисунках. Характерные сайты связывания для членов семейств Sp и p53 показаны белыми и серыми овалами соответственно.Стрелка указывает сайт начала транскрипции. ( B ) Схематическое изображение трех членов семейства транскрипционных факторов Sp (Sp1, Sp2 и Sp3), которые использовались в экспериментах по трансактивации, представленных на этом рисунке. Различные домены показаны в скобках и обозначены как A – D и DBD. Богатые серином / треонином области TAD A и B показаны светло-серыми прямоугольниками, а богатые глицином области тех же доменов — темно-серыми прямоугольниками. Цинковые пальцы DBD показаны в виде трех маленьких черных квадратов, а — / + указывает последовательности в домене C, которые модулируют транскрипционную активность факторов Sp.( C ) Схематическое изображение структуры различных членов семейства p53, используемых в настоящем исследовании. PXXP, домен гомологии 3 Src; OD, домен олигомеризации; RD, регуляторный домен. ( D ) — ( F ) Drosophila Schneider SL2 клетки временно трансфицировали конструкцией (-2325 / + 8) p21-Luc (2 мкг) вместе со специфическими векторами экспрессии для Sp1, Sp2 Drosophila или Sp3 (25 нг) независимо или в комбинации с векторами экспрессии для p53 ( D ), p73 ( E ) и p63 ( F ) (1 мкг), как указано под каждой гистограммой.Плазмиду hsp-lacZ, экспрессирующую β-галактозидазу (1 мкг), включали в каждый образец для нормализации вариабельности трансфекции. Люциферазную активность определяли в клеточных лизатах через 48 часов после трансфекции, и значения (± S.E.M.) Из по меньшей мере двух независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах, показаны в виде относительной люциферазной активности в процентах. ( G ) Анализы иммуноблоттинга, показывающие экспрессию различных членов семейства р53 в клетках Drosophila Schneider SL2. WB, Вестерн-блоттинг.Стрелки показывают положение обнаруженных белков.

Был идентифицирован ряд генов, кодирующих участников апоптотических ответов клеток на активацию p53 после повреждения ДНК, включая ген Bax, ген IGF-BP3 (белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста), PIG ( p53-индуцированный ген) и, совсем недавно, ген, кодирующий цитохромный белок PUMA (медиатор апоптоза, регулируемый p53) [3,22,23]. С другой стороны, текущие экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эффект остановки клеточного цикла р53 опосредуется главным образом транскрипционной активацией гена ингибитора клеточного цикла p21 Cip1 .Этот ген кодирует повсеместно экспрессируемый белок, который участвует в регуляции развития клеточного цикла в клетках млекопитающих [24,25]. p21 Cip1 контролирует, зависимым от концентрации образом, активность комплексов, состоящих из циклинов, cdks (циклин-зависимых киназ) и субъединицы ДНК-полимеразы δ, называемой PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), как положительно, так и отрицательно. манера [26–28]. Подавление активности этих комплексов вызывает накопление гипофосфорилированного Rb (белка ретинобластомы) и остановку клеточного цикла в G 1 [25,29].

p53 регулирует экспрессию гена p21 Cip1 на уровне транскрипции. Промотор гена p21 Cip1 человека содержит набор из шести сайтов связывания для членов семейства факторов транскрипции Sp (специфический белок) в проксимальной области (нуклеотиды от -120 до -40), а также два дистальных связывающих p53 сайты (А) [30]. Было показано, что проксимальные Sp-связывающие сайты важны для активации промотора p21 Cip1 с помощью p53 в клетках гепатомы человека HepG2 и в клетках Drosophila Schneider SL2 [31].

Sp1 является прототипом небольшого семейства транскрипционных факторов (Sp1, Sp2, Sp3 и Sp4) с гомологичными функциональными доменами. К ним относятся два N-концевых домена, богатых глутамином и серином / треонином (домены A и B), которые необходимы для активации транскрипции, высоко заряженный регуляторный домен (домен C), DBD типа цинковых пальцев, который связывается с GC-богатые (Sp1, Sp3 и Sp4) или GT-богатые (Sp2) последовательности ДНК и C-концевой домен (домен D), который участвует в олигомеризации, а также во взаимодействиях с другими факторами транскрипции (B) [32– 34].Хотя Sp1 традиционно считается повсеместным фактором, который тесно связан с активностью основного промотора, недавно было показано, что он участвует в нескольких случаях регулируемой транскрипции генов, запускаемой множественными путями передачи сигналов и условиями метаболизма или дифференцировки. Для выполнения этой задачи Sp1 нуждается в транскрипционном взаимодействии с несколькими активаторами, специфичными для последовательности, включая NF-κB (ядерный фактор κB), YY1 (Yin Yang-1) и Rb [35–37]. Мыши, у которых ген Sp1 был инактивирован гомологичной рекомбинацией, погибают прибл.день 11.5 гестации, указывая на то, что Sp1 играет ключевую роль в развитии [38].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Рестрикционные и модифицирующие ферменты (ДНК-лигаза Т4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I и щелочная фосфатаза кишечника теленка) были приобретены в Minotech, New England Biolabs или Life Technologies. L- [ 35 S] метионин и [α- 32 P] dCTP были приобретены у Amersham Biosciences. Все реагенты для клеточной культуры [DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), фетальная бычья сыворотка, трипсин-ЭДТА и PBS] были приобретены у Life Technologies.ONPG ( или -нитрофенил-β-D-галактопиранозид), PMSF и 5-FU (5-фторурацил) были приобретены у Sigma. Козье поликлональное антитело против p73 (N-19), мышиное моноклональное антитело против p63 (4A4), мышиное моноклональное антитело против p53 (DO-1), анти-GST (глутатион-S-трансфераза) (B- 14) мышиное моноклональное антитело, козье поликлональное антитело против Sp1 (Pep-2) и козье поликлональное антитело против Sp3 (D-20) были приобретены в Santa Cruz Biotechnology. Мышиное моноклональное антитело против His 6 было приобретено в R&D Systems.Моноклональное антитело против α-тубулина было подарком доктора К. Стурнараса (Департамент фундаментальных наук, Университет Крита). Антитело против PUMA было подарком доктора Дж. Ю (отделение патологии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, США). Набор для анализа люциферазы и связанный набор in vitro TnT (транскрипция / трансляция) были приобретены у Promega.

Плазмидные конструкции

Плазмиды промотора p21 Cip1 (−2325 / + 8) p21-Luc, (−215 / + 8) p21-Luc и (−2325 / −2260, −215 / + 8) p21- Люк были описаны ранее [31,39].Векторы экспрессии pPac-Sp1, pPac-Sp2 и pPac-Sp3 Drosophila были подарены доктором Джоном Ноти (Лаборатория молекулярной биологии, Институт Гатри, Сейр, Пенсильвания, США). Экспрессионные векторы pPac-Sp1 516C (ΔA), pPac-Sp1 Δint 112 (ΔC) и pPac-Sp1 Δint 349 (ΔB + C) были описаны в другом месте [40]. Вектор экспрессии hsp-lacZ, используемый для нормализации трансфекций в клетках Drosophila Schneider SL2, был подарком д-ра К. Делидакиса (Департамент биологии, Университет Крита и IMBB, Ираклион).Векторы экспрессии для человеческих p73α и p73β были подарены доктором Уильямом Кэлином-младшим (Институт рака Даны Фарбер, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США). Векторы экспрессии для мышиных p63α и p63γ были подарены доктором Джованни Бландино (Лаборатория молекулярного онкогенеза, Институт рака Regina Elena, Рим, Италия). Векторы GST-Sp1 и GST-Sp3 были сконструированы путем субклонирования кДНК человека Sp1 и Sp3 из соответствующих векторов pPac в сайт EcoRI плазмиды pGEX-4T1 (Amersham Biosciences).Бактериальные векторы, экспрессирующие различные домены Sp1 (домены A, B, Bn, Bc, C и D), слитые с GST, были сконструированы с помощью ПЦР-амплификации соответствующих фрагментов кДНК Sp1 человека и последующего клонирования в вектор экспрессии pGEX-4T1 в BamHI. и сайты EcoRI. Последовательность праймеров, используемых при амплификации отдельных доменов, показана на. Векторы бактериальной экспрессии для DBD Sp1, слитого с GST или меткой His 6 -эпитопа, были подарены доктором М. Хорикоши (Лаборатория биологии развития, Институт молекулярных и клеточных биологических наук, Токийский университет, Токио, Япония).Векторы млекопитающих, экспрессирующие домены Sp1 A, B и D, слитые с GST, были сконструированы путем вырезания указанных выше фрагментов кДНК Sp1 из соответствующих векторов pGEX с помощью BamHI и NotI и их субклонирования в вектор экспрессии pEBG на тех же сайтах рестрикции. Различные фрагменты p53, клонированные в вектор pGEM4, были любезно предоставлены доктором T. Halazonetis (Программа молекулярного и клеточного онкогенеза, Институт Вистар, Филадельфия, Пенсильвания, США). Эти фрагменты вырезали с помощью HindIII и EcoRI и субклонировали в соответствующих сайтах вектора экспрессии pRK5 млекопитающих.Плазмиды pGEX-p53- (1–160) и pGEX-p53- (160–393) были подарком доктора М. Мерфи (Отдел фармакологии, Онкологический центр Fox Chase, Филадельфия, Пенсильвания, США). Вектор бактериальной экспрессии для р53 дикого типа, слитого с меткой His 6 , был сконструирован путем субклонирования полноразмерной кДНК р53 человека в сайты EcoRI и HindIII вектора pRSETB (Invitrogen). Репортерные плазмиды -336 / + 157 и -36 / + 157 PUMA-Luc были подарены доктором Бертом Фогельштейном (Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд, США).С.А.). Плазмиду (-336 / + 157 Δ-126 / -25) PUMA-Luc конструировали путем переваривания плазмиды -336 / + 157 PUMA-Luc с помощью SacII и SmaI и повторного лигирования.

Таблица 1

Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров в ПЦР

Сайты BamHI (GGATCC) и EcoRI (GAATTC) выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

Название Последовательность Назначение
Sp1-83 смысл 5′-GCG GGATCC ACAGGTGAGCTTTGACCTCACAG2 90CCACA-3 для амплификации 83262 90CCACA-3. Sp1 регион.
Антисмысловой Sp1-262 5′-GCG GAATTC GACAGGTAGCAAGGTGATGTTCCCATTC-3 ‘ Используется в качестве 3′-праймера для амплификации области 83–262 Sp1.
Sp1-263 смысл 5′-GCG GGATCC AACAGCGTTTCTGCAGCTACCTTGACT-3 ‘ Используется в качестве 5′-праймера для амплификации области 263–542 Sp1.
Антисмысловой Sp1-542 5′-GCG GAATTC GCCTTGAATTGGGTGCACCTGGATTCC-3 ‘ Используется в качестве 3′-праймера для амплификации области 263–542 Sp1.
Sp1-543 sense 5′-GCG GGATCC CTGCCGTTGGCTATAGCAAATGCCCCA-3 ‘ Используется в качестве 5′-праймера для амплификации области 543-610 Sp1.
Антисмысловой Sp1-610 5′-GCG GAATTC CGAGCCCCTTCCTTCACTGTCTTTACA-3 ‘ Используется в качестве 3′-праймера для амплификации области 543-610 Sp1.
Sp1-702 sense 5′-GCG GGATCC CAGAATAAGAAGGGAGGCCCAGGTGTA-3 ‘ Используется в качестве 5′-праймера для амплификации области 702–778 Sp1.
Антисмысловой Sp1-778 5′-GCG GAATTC TCAGAAGCCATTGCCACTGATATTAATGG-3 ‘ Используется в качестве 3′-праймера для амплификации области 702-778 Sp1.
PUMA 5′-праймер ChIP 5′-CTGTGGCCTTGTGTCTGTGAGTAC-3 ‘ Используется в качестве 5′-праймера для амплификации области -422 / -211 гена PUMA человека.
PUMA 3′-праймер ChIP 5′-CCTAGCCCAAGGCAAGGAGGAC-3 ‘ Используется в качестве 3′-праймера для амплификации области -422 / -211 гена PUMA человека.

Культуры клеток, временные трансфекции и люциферазные анализы

Клетки гепатомы человека HepG2 и фибробласты почек обезьян COS-7 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, L-глутамина и пенициллина / стрептомицина при 37 ° C, в атмосфере 5% CO 2 . Drosophila Schneider SL2 клетки культивировали в среде для насекомых Шнайдера с добавлением 10% протестированной на культуре насекомых фетальной бычьей сыворотки и пенициллина / стрептомицина при 25 ° C.Временные трансфекции выполняли методом соосаждения Ca 3 (PO 4 ) 2 с использованием 6 мкг ДНК / лунку, когда трансфекции выполняли в шестилуночных планшетах, или 35 мкг / планшет, когда трансфекции проводили в Плиты П-100. Люциферазные анализы выполняли с использованием набора для анализа люциферазы от Promega в соответствии с инструкциями производителя.

Экспрессия белков

in vitro

Экспрессия белков in vitro выполнялась с использованием связанной системы in vitro TnT в соответствии с инструкциями производителя.Мечение белков, экспрессируемых in vitro in vitro, осуществляли путем включения 20 мкКи L- [ 35 S] метионина в реакционную смесь TnT.

Бактериальная экспрессия GST-слитых белков из

Escherichia coli и связывание с гранулами глутатион-сефароза

GST-слитые белки были экспрессированы в E. coli штаммов BL21 или DH5α. Бактерии выращивали в течение ночи при разведении 1:20 и после достижения D 600 0.7, стимулировали 1 мМ IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) в течение 4 ч при 37 ° C. Затем собирали бактерии, ресуспендировали в 1/10 исходного объема культуры PBS, обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут в PBS на льду, лизировали добавлением Triton X-100 до конечной концентрации 1% и вращали при 4 ° C в течение 30 минут. мин. Затем лизаты очищали центрифугированием при 12500 g в течение 10 минут при 4 ° C. Осадки повторно растворяли в 500 мкл буфера для солюбилизации (1 мМ EDTA, 25 мМ триэтаноламин и 1.5% N -лаурилсаркозин) в течение 10 минут при 4 ° C при осторожном перемешивании. Добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 2% и CaCl 2 до конечной концентрации 1 мМ, и лизаты очищали центрифугированием при 12500 g в течение 10 минут при 4 ° C. Солюбилизацию экспрессированных белков контролировали с помощью SDS / PAGE (10,5% полиакриламида) и окрашивания кумасси синим.

Гранулы глутатиона-сефарозы 4B уравновешивали в PBS и смешивали с 1 об.экспрессируемых бактериями GST-гибридных белков на роторном шейкере в течение 2 ч при 4 ° C. Гранулы промывали один раз равным объемом 2-кратного буфера взаимодействия [40 мМ Hepes, pH 7,9, 10 мМ MgCl 2 , 0,4% NP40 (Nonidet P40), 15% глицерина, 0,4% BSA, 2 мМ PMSF и 10 мМ PMSF. мкг / мл апротинина]. Эффективность связывания контролировали с помощью SDS / PAGE (10,5% полиакриламида) и окрашивания кумасси синим.

Очистка белков с меткой His

6 из E. coli и связывание с гранулами Ni-NTA (Ni 2+ -нитрилотриацетат)

Слитые белки с меткой His 6 были очищены из E.coli штаммов BL21 или DH5α следующим образом. Бактерии выращивали в течение ночи, разбавляли 1:20 и после достижения D 600 0,7 стимулировали 1 мМ IPTG в течение 2–3 часов при 37 ° C. Затем собирали бактерии, ресуспендировали в 1/10 исходного объема культуры буфера A (50 мМ Hepes / KOH, pH 7,9, 0,15 М NaCl, 20% глицерин, 0,1% NP40, 5 мМ имидазол, 0,5% BSA, 14,33 мМ. 2-меркаптоэтанол и ингибиторы протеаз), лизировали добавлением лизоцима (1 мг / мл) в течение 30 минут на льду и обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут.Затем лизаты очищали центрифугированием при 16060 g в течение 30 минут при 4 ° C. Осадки повторно растворяли в 500 мкл буфера для солюбилизации в течение 10 мин при 4 ° C при осторожном перемешивании. Добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 2% и CaCl 2 до конечной концентрации 1 мМ, и лизаты очищали центрифугированием при 12500 g в течение 10 минут при 4 ° C. Солюбилизацию экспрессированных белков контролировали с помощью SDS / PAGE (10.5% полиакриламида) и окрашивание кумасси синим.

Гранулы Ni-NTA уравновешивали в буфере А и смешивали с 10 об. Бактериально экспрессируемых белков, меченных His 6, , на роторном шейкере в течение 2 ч при 4 ° C. Бусины были промыты семь раз 10 об. буфера B (50 мМ Hepes, pH 7,9, 0,5 М NaCl, 0,1% NP40, 10% глицерина, 50 мМ имидазол и ингибиторы протеаз). Связанные белки элюировали шариком с равным об. буфера C (50 мМ Трис / HCl, pH 8,0, 0,5 М NaCl, 0,1% NP40, 10% глицерин, 250 мМ имидазол и ингибиторы протеаз) в течение 10 мин при 4 ° C.Гранулы удаляли центрифугированием при 16060 g в течение 1 мин при 4 ° C. Очистку контролировали на каждой стадии с помощью SDS / PAGE (10,5% полиакриламида) и окрашивания кумасси синим или с помощью вестерн-блоттинга. Элюаты хранили при -80 ° C до использования.

GST pull-down анализы

Для реакции связывания соответствующее количество суспензии гранул GST-сефарозы 1: 1 в 2-кратном буфере взаимодействия объединяли с 5-15 мкл лизата ретикулоцитов, меченного 35 S или соответствующее количество аффинно очищенных белков, меченных His 6 , в конечном объеме 400 мкл на роторном шейкере в течение 2 часов (белки, меченные His 6 ) или в течение ночи ( in vitro, транслируемые белки ) при 4 ° С.Затем шарики промывали четыре раза (по 15 мин) 20 об. промывочного буфера (20 мМ Hepes, pH 7,9, 100–350 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,2% NP40 и ингибиторы протеаз), а связанные белки элюировали кипячением в загрузочном буфере Laemmli SDS / PAGE и подвергали SDS / PAGE (10,5% полиакриламида). Связанные белки визуализировали либо радиоавтографией, либо вестерн-блоттингом с использованием мышиных моноклональных антител против His 6 .

Анализы совместной иммунопреципитации

Для экспериментов по совместной иммунопреципитации клетки COS-7 или клетки HEK-293T (эмбриональная почка человека) дважды промывали ледяным PBS и собирали в PBS.Клетки осаждали центрифугированием при 12500 g в течение 10 минут при 4 ° C и ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ Трис / HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10% глицерина и 1% Тритона X-100) с добавками. с ингибиторами протеаз (1 мМ PMSF, 13 мкг / мл апротинина и 6,7 мкг / мл лейпептина). Лизаты собирали центрифугированием при 12500 g в течение 10 мин при 4 ° C, затем предварительно очищали инкубацией с 30 мкл протеина A-Sepharose Fast Flow, предварительно уравновешенного лизисным буфером на вращающейся платформе при 15 оборотах./ мин в течение 3 часов при 4 ° C, затем 30 секунд центрифугирования и сбора супернатанта. Супернатанты инкубировали с надлежащим разведением первого антитела на вращающейся платформе при 15 об / мин в течение ночи при 4 ° C с последующей инкубацией с 30 мкл гранул Protein G-Sepharose Fast Flow, предварительно уравновешенных в буфере для лизиса, в течение 3 часов. . Гранулы трижды промывали буфером для лизиса, осаждали и ресуспендировали в равном объеме 2 × загрузочного буфера SDS. Иммунопреципитированные белки анализировали с помощью SDS / PAGE (8.5% полиакриламида) с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную переносящую мембрану Protran с размером пор 0,45 мкм (Schleicher and Schuell). Иммуноблоттинг выполняли с надлежащим разведением второго антитела с последующей инкубацией с антителом, конъюгированным с HRP (пероксидаза хрена), и визуализацией путем обработки субстратом усиленной хемилюминесценции (Pierce).

Анализ GST млекопитающих «pull-down»

Трансфицированные клетки HEK-293T промывали ледяным PBS и собирали в PBS.Клетки осаждали центрифугированием при 6200 g в течение 5 минут при 4 ° C и ресуспендировали в буфере для лизиса с добавлением ингибиторов протеаз (1 мМ PMSF и 1 мМ бензамидин). Лизаты собирали центрифугированием при 16060 g в течение 4 минут при 4 ° C после инкубации на вращающейся платформе в течение 30 минут при 4 ° C. Супернатанты инкубировали с шариками глутатион-сефароза 4B, предварительно уравновешенными в PBS на вращающейся платформе в течение 4 часов при 4 ° C. Гранулы трижды промывали буфером для лизиса, осаждали и ресуспендировали в равном объеме 2 × загрузочного буфера SDS.Белки, связанные с шариками, анализировали с помощью SDS / PAGE (10,5% полиакриламида) с последующим электропереносом на мембрану для переноса нитроцеллюлозы Protran с размером пор 0,45 мкм. Иммуноблоттинг проводили с поликлональным антителом против р53 с последующей инкубацией с конъюгированным с HRP антимышиным антителом и визуализацией обработкой субстратом усиленной хемилюминесценции.

Гелевые EMSA (анализ электрофоретической подвижности)

Гелевые EMSA проводили, как описано ранее [41], с использованием экстрактов из клеток Drosophila Schneider SL2, трансфицированных различными векторами экспрессии pPac-Sp1.Смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды отжигали для получения двухцепочечного олигонуклеотидного зонда и метили фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и [α- 32 P] dCTP. Последовательность смыслового олигонуклеотида, используемого в качестве зонда, была p21 (-86 / -70): 5′-GGGGGTCCCGCCTCCTTGA-3 ‘.

ChIP (иммунопреципитация хроматина)

Клетки HepG2, выращенные в чашках P-100, обрабатывали 5-ФУ (50 мкг / мл) в течение 24 часов или оставляли без обработки. Анализ ChIP выполняли, как описано ранее [42], с использованием моноклонального антитела против p53.Иммунопреципитированный хроматин анализировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, соответствующих проксимальной области -422 / -211 промотора гена PUMA человека. Последовательность праймеров приведена в. Продукты амплификаций ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Функциональное сотрудничество между членами семейств факторов транскрипции Sp и p53 усиливает активность человеческого промотора p21

Cip1

Для исследования потенциального участия различных членов семейства Sp в индукции транскрипции, опосредованной p53 промотора p21 Cip1 мы провели анализ трансактивации в клеточной линии Drosophila Schneider SL2 [43].Эти клетки лишены эндогенных Sp1 или Sp1-связанных активностей и, таким образом, они представляют собой очень полезную систему для изучения Sp-зависимых транскрипционных ответов [44]. Drosophila Schneider SL2 клетки временно трансфицировали репортерной плазмидой, несущей ген люциферазы под контролем человеческого (-2325 / + 8) промотора p21 Cip1 отдельно или вместе с векторами экспрессии для Sp1, Sp2 человека дикого типа, Sp3 и p53. Как показано на (D), Sp1 и Sp3, но не Sp2, трансактивировали промотор p21 Cip1 до низкой степени в конкретных экспериментальных условиях (3-5 раз).Напротив, экспрессируемый один р53 не смог трансактивировать промотор p21 Cip1 в клетках Drosophila Schneider SL2, несмотря на присутствие двух сайтов связывания для этого белка в дистальной области (А). Отсутствие трансактивации промотора p21 Cip1 с помощью p53 не было связано с неэффективной экспрессией этого белка в клетках Drosophila Schneider SL2 (G). Важно отметить, что совместная экспрессия Sp1 или Sp3 с p53 вызвала сильную синергетическую трансактивацию промотора p21 Cip1 (37-кратную и 30-кратную.В 5 раз соответственно). Напротив, Sp2 не смог трансактивировать промотор p21 Cip1 в присутствии сверхэкспрессированного p53 (D).

Мы использовали ту же систему для исследования потенциальных функциональных взаимодействий между белками семейства Sp с четырьмя дополнительными членами семейства p53: p73α, p73β, p63α и p63γ (C). Для этой цели использовали векторы экспрессии для указанных выше членов семейства p53, чтобы обеспечить эффективную экспрессию этих белков в клетках Drosophila Schneider SL2 (G).Как показано на (E), как p73α, так и p73β усиливали транскрипцию гена люциферазы, управляемую промотором -2325 / + 8 p21 Cip1 только в присутствии Sp1 или Sp3, сильно синергетическим образом. Синергетические взаимодействия между изоформами Sp1 и p63 α и γ при трансактивации промотора p21 Cip1 также наблюдались в клетках Drosophila Schneider SL2 (F).

Таким образом, представленные результаты показывают, что факторы Sp имеют важное значение для трансактивации промотора p21 Cip1 членами семейства белков p53, и что высокие уровни активности промотора p21 Cip1 могут быть достигнуты путем совместной -операционное взаимодействие между членами двух семей.

Регуляция транскрипции гена PUMA посредством функциональных взаимодействий между p53 и Sp1

Чтобы установить важность Sp1 и родственных факторов для опосредованных p53 транскрипционных ответов, мы исследовали способ регуляции дополнительного гена, который также содержит сайты связывания для обоих классы факторов транскрипции в его промоторе. Промотор гена, кодирующего цитохромный белок PUMA, содержит набор из 10 потенциальных сайтов связывания для белков семейства Sp в проксимальной области между нуклеотидами -120 и -8, фланкированных двумя последовательностями распознавания p53 на 5′-конце между нуклеотидами -229 / −209 и −145 / −126 (А).Было показано, что белок PUMA в основном отвечает за апоптотические ответы клеток колоректального рака на индукцию p53 [22,23]. Активация p53 повреждающими ДНК агентами, такими как 5-FU, сопровождалась индукцией экспрессии гена PUMA (B), и эта индукция была связана с усиленным привлечением эндогенного белка p53 к промотору гена PUMA (C). Как и в случае p21 Cip1 , сверхэкспрессия p53 в клетках Drosophila Schneider SL2 активировала (-336 / + 157) промотор PUMA только в присутствии Sp1 (D) или Sp3 (результаты не показаны), предполагая функциональное сотрудничество между факторами p53 и Sp в регуляции экспрессии гена PUMA.Чтобы подтвердить этот вывод, мы сконструировали мутантный промотор PUMA, лишенный большинства проксимальных Sp-связывающих мотивов, которые сгруппированы в области между нуклеотидами -126 и -25 (-336 / + 157 Δ-126 / -25 PUMA-Luc). (А). Как показано на (D), наблюдались очень низкие уровни трансактивации этого мутантного промотора PUMA с помощью Sp1, которые не могли быть дополнительно усилены p53, несмотря на присутствие двух сайтов связывания p53 в мутантном промоторе PUMA. Сходные результаты были получены, когда мутант PUMA, лишенный сайтов связывания Sp1- и p53 (-36 / + 157 PUMA-Luc) (A), использовали в экспериментах по трансактивации (D).

Sp1 необходим для трансактивации промотора PUMA человека с помощью p53

( A ) Схематическое изображение 5′-регуляторной области PUMA и трех репортерных конструкций PUMA-Luc, которые использовались в экспериментах по трансактивации ( D ). Характерные или потенциальные сайты связывания для членов семейства Sp и p53 на промоторе PUMA показаны белыми и серыми овалами соответственно. Стрелки показывают положение праймеров, использованных в эксперименте ChIP ( C ).Удаленная область -126 / -25 показана пунктирной линией. ( B ) Активация экспрессии гена PUMA агентами, повреждающими ДНК. Клетки HepG2 обрабатывали 50 мкг / мл 5-FU (+ 5-FU) или оставляли без обработки (-5-FU) в течение 24 часов. Экстракты цельных клеток анализировали на экспрессию эндогенного р53, PUMA и альфа-тубулина с помощью иммуноблоттинга. WB, Вестерн-блоттинг. ( C ) Анализ ChIP с использованием клеток HepG2, обработанных 50 мкг / мл 5-FU (+ 5-FU) или оставленных необработанными (-5-FU). Моноклональное антитело, распознающее р53, использовали для иммунопреципитации хроматина.Реакции ПЦР проводили с праймерами, соответствующими участкам -422 и -211 промотора PUMA (показаны в A ). ( D ) Drosophila Schneider SL2 клетки были временно трансфицированы репортерными плазмидами PUMA-Luc, показанными в ( A ), вместе со специфическим для Drosophila вектором экспрессии Sp1 (25 нг) и вектором экспрессии для белок p53 дикого типа (1 мкг) человека независимо или в комбинации, как указано под гистограммой.Плазмиду hsp-lacZ, экспрессирующую β-галактозидазу (1 мкг), включали в каждый образец для нормализации вариабельности трансфекции. Люциферазную активность определяли в клеточных лизатах через 48 часов после трансфекции, и значения (± S.E.M.) По меньшей мере из двух независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах, представлены в виде относительной люциферазной активности в процентах.

Результаты, представленные в, предполагают, что, как и в случае p21 Cip1 , p53 не может активировать промотор PUMA человека в отсутствие факторов Sp или при мутации сайтов связывания Sp.Таким образом, механизм транскрипционной активации гена PUMA повреждающими ДНК лекарствами или другими стимулами может включать, по крайней мере частично, функциональные взаимодействия между факторами p53 и Sp, которые связываются с соседними областями промотора PUMA.

Домены в p53, которые опосредуют физические взаимодействия с Sp1 и Sp3

Физические взаимодействия между p53 и Sp1 могут объяснять синергетическую трансактивацию промоторов p21 Cip1 и PUMA двумя факторами [31]. Чтобы идентифицировать домены в p53, которые опосредуют физические взаимодействия с Sp1, эксперименты с GST-pull-down были выполнены с использованием форм дикого типа или мутантных форм p53, показанных на (A).Эти белки продуцировались in vitro TnT в присутствии L- [ 35 S] метионина (B) и позволяли взаимодействовать только с GST-Sp1 или GST, экспрессируемыми в бактериях и связанными с гранулами глутатиона-сефарозы. Как показано на (C), наблюдались специфические физические взаимодействия между Sp1 и wt p53 или N-концевыми мутантами p53 Δ3–79, Δ13–19 и Δ34–70. С другой стороны, мутации в С-концевой части р53 (Δ300–321, Δ293–393 и Δ363–393) в разной степени повлияли на его взаимодействие с Sp1.Наиболее резкое ингибирование взаимодействий p53 / Sp1 наблюдалось с мутантом p53 Δ293–393, у которого отсутствует весь C-концевой 101-аминокислотный участок (C). Использование двух дополнительных мутантов p53, p53- (1–160) и p53- (160–393) подтвердило, что C-концевая половина белка (аминокислоты 160–393) содержит по крайней мере одну поверхность взаимодействия для Sp1.

Домены в опухолевом супрессоре p53, которые опосредуют физические взаимодействия с Sp1

( A ) Схематическое изображение белков p53 дикого типа (wt) и мутантных белков p53, используемых в экспериментах GST pull-down ( C ) и ( E ).Название каждого мутанта p53 показано слева. Сокращения такие же, как в (C). ( B ) Человеческий белок p53 дикого типа (wt) или указанные мутантные формы транскрибировали и транслировали in vitro в присутствии L- [ 35 S] метионина. Продукты каждой реакции анализировали с помощью SDS / PAGE с последующей авторадиографией. M, молекулярно-массовый маркер белка (размеры в кДа). ( C ) Белки p53 дикого типа и мутантные белки p53, продуцируемые in vitro TnT, инкубировали с GST или GST-Sp1-связанными гранулами глутатиона-сефарозы, как описано в разделе «Материалы и методы».Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и авторадиографии. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию. ( D ) Совместная иммунопреципитация Sp1 с белками p53 дикого типа (wt) и белками p53 Δ363–393. Клетки HEK-293T трансфицировали векторами экспрессии для p53 дикого типа (первая и вторая дорожки) или мутанта p53 Δ363–393 (третья дорожка) и подвергали иммунопреципитации (IP) с использованием поликлональных антител против Sp1 (вторая и третья дорожки). ) или отсутствие антител в качестве контроля (первая полоса).Иммунопреципитированные белки, а также исходный материал (WCE, экстракт цельных клеток) подвергали SDS / PAGE и анализировали вестерн-блоттингом (WB) с использованием моноклонального антитела против p53. ( E ) Совместная иммунопреципитация эндогенных белков Sp3 и p53. Полные клеточные экстракты из клеток COS-7 подвергали иммунопреципитации (IP) с использованием моноклонального антитела против p53 (анти-p53) или неродственного антитела в качестве контроля (анти-myc), как описано в разделе «Материалы и методы».Иммунопреципитаты подвергали SDS / PAGE и вестерн-блоттингу (WB) с использованием поликлонального антитела против Sp3 или того же антитела против p53, которое использовалось для иммунопреципитации. Положения Sp3 и p53, обнаруженные с помощью вестерн-блоттинга, показаны стрелками. ( F ) Домены в p53, участвующие в физических взаимодействиях с Sp3. Белок p53 дикого типа (wt) человека или указанные мутантные формы транскрибировали и транслировали in vitro в присутствии L- [ 35 S] метионина и инкубировали с GST или GST-Sp3-связанными гранулами глутатиона-сефарозы. как описано в разделе «Материалы и методы».Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и авторадиографии. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию. Сводка взаимодействий мутантов p53 с Sp1 и Sp3 приведена в ( A ).

Физические взаимодействия между p53 и Sp1 были также исследованы in vivo с помощью анализов коиммунопреципитации. Как показано на (D), Sp1, эндогенно экспрессируемый в клетках HEK-293T, сильно взаимодействовал с экзогенным p53 дикого типа и слабо с экзогенным p53 Δ363–393 в соответствии с анализом in vitro GST pull-down, показанным на (C).

Чтобы исследовать, может ли Sp3 также физически и функционально взаимодействовать с p53, были использованы анализы межбелкового взаимодействия. Во-первых, физические взаимодействия между Sp3 и p53 in vivo были установлены с помощью анализа коиммунопреципитации с использованием эндогенных белков, экспрессируемых в фибробластах COS-7. Как показано на (E), моноклональное антитело против p53 коиммунопреципитировало эндогенные белки Sp3 и p53, тогда как при использовании неродственного антитела (анти-myc) иммунопреципитации Sp3 не наблюдалось.Чтобы проверить физическое взаимодействие между Sp3 и p53, были также проведены анализы in vitro и GST pull-down. Как показано на (F), p53 дикого типа взаимодействует специфически с GST-Sp3, но не с GST. Чтобы идентифицировать домены p53, которые опосредуют физические взаимодействия с Sp3, репрезентативные усеченные формы p53, показанные на (A), были использованы в анализах GST pull-down. Этот анализ показал, что мутации в N-концевой области p53 (Δ3–79 и Δ34–70) не влияют на его способность физически связываться с Sp3 (F).Напротив, все мутации в C-концевой части p53 (Δ300–321, Δ293–393 и Δ363–393) устраняют физические взаимодействия между p53 и Sp3 (F).

Результаты, представленные в таблице, показали, что p53 взаимодействует физически и функционально с двумя членами семейства Sp вездесущих факторов транскрипции, Sp1 и Sp3, и что С-концевые 101 аминокислоты из 53 оказались важными для его физического взаимодействия с оба фактора. Сводка данных взаимодействия показана на (A).

Физические взаимодействия между белками семейства Sp и дополнительными членами семейства p53, такими как p73α и p73β, также были исследованы с помощью анализов GST pull-down.С этой целью две изоформы p73 продуцировались in vitro TnT в присутствии L- [ 35 S] метионина и позволяли взаимодействовать с GST-Sp1, GST-Sp3 или GST отдельно, экспрессируемыми в бактериях и связанными с гранулы глутатиона-сефарозы. Как показано на фиг.1, наблюдались определенные физические взаимодействия между Sp1 и Sp3 как с p73α, так и с p73β. p73α сильнее взаимодействовал с Sp3, чем с Sp1, тогда как для p73β верно обратное. Физические взаимодействия между белками Sp и p73 могут объяснять транскрипционную кооперативность между ними при трансактивации промотора p21 Cip1 (E).

Физические взаимодействия между белками Sp и p73

Белки p73α и p73β дикого типа человека транскрибировали и транслировали in vitro в присутствии L- [ 35 S] метионина и инкубировали с GST, GST-Sp1 или GST-Sp3-связанные гранулы глутатиона-сефарозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и авторадиографии. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию.Стрелки показывают электрофоретическое положение связанных белков р73.

Затем мы определили транскрипционную активность каждого мутанта р53 в анализах трансактивации с использованием промотора р21 человека -2325 / + 8. Как показано на (A), сверхэкспрессия человеческого p53 дикого типа в фибробластах COS-7 вызвала сильную трансактивацию промотора p21 Cip1 (23-кратную). Эта трансактивация ослаблялась внутренними делециями, которые удаляли весь или часть TAD p53 (1,3- и 4,5-кратная трансактивация мутантами p53 Δ3–74 и Δ34–78 соответственно), тогда как внутренняя делеция вне TAD (p53 мутант Δ13–19) имел менее выраженный эффект (16-кратная трансактивация).Делеции, удаляющие различные сегменты C-концевой области p53, также анализировали на их способность трансактивировать промотор p21 Cip1 в клетках COS-7. Как показано на (A), внутренние делеции, которые удаляли 22-аминокислотную область непосредственно на N-конце домена тетрамеризации (мутант p53 Δ300–321) или которые удаляли регуляторный домен (мутант p53 Δ363–393), имели минорную влияние на трансактивацию промотора p21 Cip1 (в 20 и 18 раз соответственно).Напротив, делеция С-концевой 101 аминокислоты р53 (мутант р53 Δ293–393) резко снижает, хотя и не полностью устраняет транскрипционную активность этого белка (3,4-кратная трансактивация). Различия в транскрипционной активности различных мутантов p53 нельзя объяснить различиями в уровнях экспрессии этих белков в клетках COS-7, как показал анализ иммуноблоттинга (B).

Трансактивация промотора p21 Cip1 диким типом и мутантными белками p53

( A ) Клетки COS-7 трансфицировали репортерной плазмидой (-2325 / + 8) p21-Luc (2 мкг) вдоль с векторами экспрессии для указанных белков дикого типа (wt) или мутантных белков p53 (1 мкг).Каждый образец включал плазмиду CMV (цитомегаловируса) -β-gal, экспрессирующую β-галактозидазу (1 мкг) для нормализации вариабельности трансфекции. Показана нормализованная относительная активность люциферазы по крайней мере двух независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. ( B ) Мониторинг экспрессии белков p53 дикого типа (wt) и мутантных белков в клетках COS-7 с помощью иммуноблоттинга. Клетки COS-7 (чашки диаметром 100 мм) трансфицировали векторами экспрессии указанных белков или не трансфицировали (-).Полные экстракты клеток COS-7 подвергали SDS / PAGE и вестерн-блоттингу (WB) с использованием моноклонального антитела против p53. Положение wt p53 показано стрелкой, а мутантная форма p53 — скобкой. Звездочкой показан мутант p53 (Δ3–74), который не может быть обнаружен антителом против p53 из-за отсутствия эпитопа, который распознает это антитело. Полоса в нетрансфицированных клетках и в клетках, трансфицированных мутантом р53 (Δ3–74), соответствует эндогенному белку р53, который также распознается моноклональным антителом против р53.

Для дальнейшего исследования важности С-концевой 101 аминокислоты р53 (аминокислоты 293–393) для ее функционального взаимодействия с Sp1, анализы транскрипционного синергизма были выполнены на клетках Drosophila Schneider SL2. В этой серии экспериментов усеченная конструкция промотор p21 Cip1 – люцифераза, состоящая из проксимального кластера сайтов связывания Sp1 / Sp3 (-215 / + 8), а также того же фрагмента промотора, связанного с дальним направлением (- 2325 / −2260) p53-связывающий сайт промотора p21 Cip1 (A) [31] трансфицировали в клетки Drosophila Schneider SL2 отдельно или в присутствии векторов экспрессии для Sp1, p53 и мутантов p53 Δ363–393 и Δ293–393.Как показано на (B), Sp1, экспрессируемый отдельно, эффективно трансактивировал проксимальный промотор p21 -215 / + 8, у которого отсутствуют сайты связывания p53, тогда как p53 ингибировал Sp1-опосредованную трансактивацию этого промотора на 60%. Подобное ингибирование наблюдалось при использовании мутанта p53 Δ363–393, лишенного С-концевой 31 аминокислоты. Напротив, мутант p53 Δ293–393, у которого отсутствует 101 C-концевая аминокислота, не может ингибировать Sp1-опосредованную трансактивацию промотора p21 Cip1 в клетках Drosophila Schneider SL2 (B).С другой стороны, p53 и мутант Δ363–393 трансактивировали промотор p21 Cip1 , несущий дистальный сайт связывания p53 рядом с проксимальными сайтами связывания Sp1 / Sp3 независимо от Sp1, тогда как совместная экспрессия Sp1 с обеими формами p53 привело к сильной синергической трансактивации промотора p21 Cip1 (B). Напротив, мутант p53 Δ293–393 не мог трансактивировать промотор p21 Cip1 независимо или синергетически с Sp1 (B).

Важность С-концевой 101 аминокислоты р53 для функциональной кооперации с Sp1

( A ) Схематическое изображение конструкций промотора p21 Cip1 , использованных в экспериментах по трансактивации ( B ).Символы такие, как на (A). ( B ) Drosophila Schneider SL2 клетки были временно трансфицированы конструкциями (−215 / + 8) p21-Luc или (−2325 / −2260, −215 / + 8) p21-Luc (2 мкг) вдоль с Drosophila -специфическими векторами экспрессии для Sp1 (25 нг) независимо или в комбинации с вектором для белка p53 дикого типа (wt) (1 мкг), или мутантами p53 Δ363–393 и Δ293–393 белка (1 мкг), как указано. Плазмиду hsp-lacZ (1 мкг) включали в каждый образец для нормализации вариабельности трансфекции.Люциферазную активность определяли в клеточных лизатах через 48 часов после трансфекции, и значения (± S.E.M.) Из по меньшей мере двух независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах, показаны в виде относительной люциферазной активности в процентах.

Таким образом, результаты, представленные в таблице, согласуются с результатами, представленными на фигурах и, и подтверждают важность C-концевой части p53 (аминокислоты 293–393) для ее физических и функциональных взаимодействий с Sp1 и трансактивации промотор p21 Cip1 .

Домены Sp1, которые опосредуют физическое взаимодействие с p53

Для идентификации доменов Sp1, которые участвуют в физических взаимодействиях с p53, отдельные функциональные домены Sp1 были клонированы в рамке с GST и использованы в анализах GST pull-down (A) . Домены Sp1, которые были слиты с GST, представляли собой два богатых глицином и серином / треонином TAD A (аминокислоты 83–262) и B (аминокислоты 263–542), регуляторный домен C (аминокислоты 543–610). , DBD (аминокислоты 611–701) и C-концевой домен D (аминокислоты 702–778).Все указанные выше слитые с GST белки экспрессировались в E. coli и были связаны с гранулами глутатион-сефароза (B). Как показано на (C), in vitro, транскрибируется и транслируется, а 35 S-меченный белок p53 дикого типа взаимодействует с Sp1 дикого типа (аминокислоты 83–78), а также с отдельными доменами A, B и DBD. Наиболее сильное взаимодействие наблюдалось между p53 и доменом A, тогда как слабое взаимодействие p53 с DBD Sp1 можно было объяснить, по крайней мере частично, низкими уровнями экспрессии этой мутантной формы Sp1 в бактериях (B).

Домены в Sp1, участвующие в физических взаимодействиях с p53 in vitro

( A ) Схематическое изображение слитых белков GST – Sp1, используемых в экспериментах с GST pull-down ( C ), ( F ) ) и ( G ). Аббревиатуры и оттенки такие же, как на (B). ( B ) Профиль экспрессии слитых белков GST и GST – Sp1. Слитые белки GST и GST – Sp1 экспрессировали в клетках E. coli DH5α, как описано в разделе «Материалы и методы».После связывания с гранулами глутатион-сефароза и тщательной промывки аликвоту гранул анализировали на наличие связанных белков GST и GST-Sp1 с помощью SDS / PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. Относительное положение стандартов молекулярной массы показано слева (в кДа). ( C ) Белок p53 дикого типа транскрибировали и транслировали in vitro в присутствии L- [ 35 S] метионина и инкубировали с гранулами глутатион-сефароза, связанными с GST или другим слиянием GST-Sp1. белки, как указано.Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и авторадиографии. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию. Относительное положение стандартов молекулярной массы показано слева (в кДа). ( D ) Физические взаимодействия между доменами А и В p53 и Sp1 in vivo . Клетки HEK-293T трансфицировали векторами, экспрессирующими указанные домены Sp1, слитые с GST или только с GST, вместе с вектором экспрессии для p53 дикого типа. Экстракты трансфицированных клеток инкубировали с гранулами глутатион-сефароза, а связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и иммуноблоттинга с использованием антитела против p53 (верхняя панель).Экспрессию p53 и слитых белков GST-Sp1 контролировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против p53 и GST соответственно (средняя и нижняя панели). WB, Вестерн-блоттинг. ( E ) Очистка человеческого белка p53 дикого типа, меченного His 6, из E. coli . Очистку His 6 –p53 контролировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. M, стандарты молекулярной массы (размеры в кДа). ( F , G ) Очищенный His 6 белок р53 дикого типа, меченный , инкубировали с гранулами глутатион-сефароза, связанными с GST или различными слитыми белками GST-Sp1, как указано.Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител, специфичных к метке His 6 -эпитопа. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию. Положение белка p53 с меткой His 6 показано стрелкой. WB, Вестерн-блоттинг. ( H ) Очистка His 6 -меченного DBD человеческого белка Sp1 из E. coli . Очистку His 6 –Sp1 DBD проводили, как описано в разделе «Материалы и методы», и контролировали с помощью SDS / PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим.M, стандарты молекулярной массы (размеры в кДа). ( I ) Очищенный His 6 –Sp1 DBD инкубировали с гранулами глутатион – сефароза, соединенными с GST или GST – p53, как указано. Связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE и иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител, специфичных к метке His 6 -эпитопа. Входные данные представляют собой 20% исходного образца белка, использованного в экспериментах по связыванию. Положение белка Sp1 DBD с меткой His 6 показано стрелкой. WB, Вестерн-блоттинг.

Физические взаимодействия между p53 и отдельными доменами Sp1 также были исследованы in vivo . Для этой цели векторы экспрессии млекопитающих, несущие фрагменты кДНК Sp1, соответствующие доменам A, B и D, слитым с GST, трансфицировали в клетки HEK-293T вместе с p53 дикого типа. Экстракты трансфицированных клеток инкубировали с гранулами глутатион-сефароза, а связанные белки анализировали с помощью SDS / PAGE (10,5% полиакриламида) и иммуноблоттинга с использованием антитела против p53.Как показано на (D), p53 дикого типа сильно взаимодействовал с доменом A Sp1 и слабо с доменом B Sp1, но не взаимодействовал с доменом D Sp1 в соответствии с анализом in vitro с понижением уровня GST, показанным на (C ).

Для подтверждения взаимодействия p53 с множественными доменами Sp1, анализы GST pull-down были выполнены с использованием белка p53, несущего метку His 6 -эпитопа на N-конце. Белок His 6 –p53 был экспрессирован в бактериях, очищен до гомогенности с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA (E), и ему позволили взаимодействовать с GST, GST – Sp1- (83–778), GST – Sp1- (83– 262) и GST – Sp1- (263–542) белки.Взаимодействие контролировали иммуноблоттингом с использованием моноклонального антитела, индуцированного против метки His 6 -эпитопа. Как показано на (F), аффинно очищенный р53 дикого типа специфично и эффективно взаимодействовал с полноразмерным Sp1 (аминокислоты 83–778), а также с отдельными доменами Sp1 A (аминокислоты 83–262) и B (аминокислоты 83–262) и B (аминокислоты 83–778). кислоты 263–542), что подтверждает результаты, показанные в (C) и (D). Дальнейшее рассечение домена B Sp1 показало, что субрегион, богатый серином / треонином этого домена, определяемый остатками 263–424, достаточен сам по себе, чтобы опосредовать физическое взаимодействие с очищенным сродством p53 (G).

В параллельном эксперименте DBD Sp1, слитого с меткой His 6 -эпитопа, экспрессировали в бактериях, очищали с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA (H) и позволяли взаимодействовать с белками GST или GST-p53. Опять же, взаимодействие контролировали иммуноблоттингом с использованием моноклонального антитела, индуцированного против метки His 6 -эпитопа. Как показано в (I), очищенный с помощью аффинности DBD Sp1 специфически и эффективно взаимодействовал с p53 дикого типа, таким образом подтверждая результаты (C).

Таким образом, результаты, представленные в, показывают, что p53 взаимодействует с несколькими доменами Sp1, включая два TAD A и B, а также DBD.

Для исследования вклада отдельных доменов Sp1 в его функциональный синергизм с p53 в трансактивации промотора p21 Cip1 , делеционные мутанты Sp1, лишенные специфических доменов белка, трансфицировали в клетки Drosophila Schneider SL2 по отдельности или вместе с р53, и их трансактивационные свойства контролировали с помощью люциферазных анализов с использованием вектора (-2325 / + 8) p21-Luc в качестве репортера.Мутантные белки Sp1, которые использовались в этих анализах, включают Sp1 ΔC, ΔB + C и ΔA, лишенные доменов C, B + C и A соответственно (A). Экспрессию Sp1 дикого типа, а также трех мутантных форм в клетках Drosophila Schneider SL2 контролировали с помощью гелевого EMSA с использованием экстрактов трансфицированных клеток Drosophila Schneider SL2 и радиоактивно меченного двухцепочечного олигонуклеотида, соответствующего Sp1 / Сайт 3 Sp3 (-86 / -70) проксимального промотора p21 Cip1 [39] (B).Как показано на (C), мутант Sp1 ΔC, у которого отсутствует регуляторный домен C, трансактивировал (-2325 / + 8) промотор p21 прибл. В 8 раз более эффективно, чем Sp1 дикого типа при трансфекции только в клетки Drosophila Schneider SL2, и в 3 раза более эффективно, чем Sp1 дикого типа, когда два белка котрансфицировали р53. Мутант Sp1 ΔB + C трансактивировал промотор p21 Cip1 в 3 раза эффективнее, чем Sp1 дикого типа в отсутствие p53, тогда как в присутствии p53 трансактивация была сопоставима с трансактивацией Sp1 дикого типа.Наконец, мутант Sp1 ΔA, который несет внутреннюю делецию домена A, имел очень низкую транскрипционную активность даже в присутствии p53, что согласуется с предыдущими данными [45] (C).

Вклад отдельных доменов Sp1 в его функциональный синергизм с p53 в трансактивации промотора p21 Cip1

( A ) Схематическое изображение Sp1 дикого типа и мутантных форм, используемых для связывания ДНК и эксперименты по трансактивации ( B ) и ( C ).Сокращения такие же, как в (B). ( B ) Связывание Sp1 дикого типа и мутантных форм, экспрессируемых в клетках Drosophila Schneider SL2, с проксимальным промотором p21 Cip1 . Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, соответствующий области промотора -86 / -70 p21 Cip1 , был помечен [α- 32 P] dCTP и подвергнут гелевому EMSA с использованием экстрактов из трансфицированных клеток Drosophila Schneider SL2, как описано в разделе «Материалы и методы».Комплексы Sp1-ДНК анализировали с помощью нативного PAGE и детектировали с помощью авторадиографии. ( C ) Drosophila Schneider SL2 клетки временно трансфицировали конструкцией (-2325 / + 8) p21-Luc (2 мкг) вместе с Drosophila -специфическими векторами экспрессии для Sp1 дикого типа или мутантных форм Sp1 (25 нг), как указано под гистограммой, или не были трансфицированы (-) в отсутствие или в присутствии вектора экспрессии для человеческого p53 дикого типа (1 мкг). Плазмиду hsp-lacZ (1 мкг) включали в каждый образец для нормализации вариабельности трансфекции.Люциферазную активность определяли в клеточных лизатах через 48 часов после трансфекции, и значения (± S.E.M.) Из по меньшей мере двух независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах, показаны в виде относительной люциферазной активности в процентах.

Результаты показывают, что домен A Sp1, который физически взаимодействует с p53, важен для его транскрипционной активности и его функционального синергизма с p53 в трансактивации промотора p21 Cip1 , тогда как домен C, который не взаимодействует физически с p53, по-видимому, играет ингибирующую роль в обоих процессах.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы исследовали механизм транскрипционного синергизма между белками семейства Sp и членами семейства р53 белков-супрессоров опухолей. Такой механизм может играть важную роль в опосредованной p53 стимуляции транскрипции генов, содержащих сайты связывания для обоих классов факторов транскрипции в их промоторах, как показано на примере гена ингибитора клеточного цикла p21 Cip1 () и проапоптотический ген PUMA ().Промоторы этих двух генов имеют сходное расположение сайтов связывания p53 и Sp, то есть оба они содержат кластер GC-богатых мотивов, фланкированных двумя мотивами распознавания p53 на 5′-конце (A и A). В случае промотора p21 Cip1 , сайты p53 расположены в дистальных областях относительно проксимальных сайтов Sp, указывая тем самым, что промежуточные последовательности, возможно, должны выходить из петли, чтобы облегчить взаимодействия Sp-p53. В поддержку этой гипотезы мы наблюдали, что p53 может активировать искусственный промотор p21 Cip1 , содержащий дистальный (-2325 / -2260) сайт p53, расположенный рядом с проксимальной (-215 / + 8) областью в Drosophila Schneider SL2. клетки в отсутствие факторов Sp, тогда как он не может этого сделать, когда сайт присутствует в своем естественном положении ().Т.о., в случае промотора p21 Cip1 , взаимодействия p53-Sp могут потребоваться для того, чтобы облегчить рекрутирование p53 в проксимальную область промотора и его ассоциацию с базальным аппаратом транскрипции.

Sp1 связывается с ДНК и активирует транскрипцию как олигомер, а домен D Sp1 способствует функциональному взаимодействию между молекулами Sp1 на промоторах, которые содержат несколько сайтов связывания Sp1, таких как p21 Cip1 и промоторы PUMA [46 ].Действительно, мы показали, что белки Sp1 активируют промотор p21 Cip1 кооперативным образом, тогда как удаление домена D отменяет эту кооперативность [39]. Белки p53 также связываются с ДНК как гомотетрамеры (как димеры димеров), и связыванию ДНК способствует присутствие двух инвертированных пар консенсусной последовательности ДНК 5′-RRRC (A / T) -3 ‘в промоторах генов-мишеней. [10]. Возможность образования мультибелковых комплексов, состоящих из олигомеров Sp1 и p53, подтверждается нашим открытием, что p53 может взаимодействовать с множеством доменов Sp1, включая два TADs A и B, а также DBD ().Формируют ли домены A, B и DBD Sp1 протяженную контактную поверхность для p53 из-за их близости в пространстве, еще предстоит определить с помощью кристаллографического анализа. Альтернативно, независимые контакты p53 с разными доменами Sp1 могут происходить в контексте мультибелковых комплексов, состоящих из олигомеров каждого белка, как предложено выше.

Помимо p53, мы обнаружили, что факторы Sp могут физически и функционально взаимодействовать с недавно описанными дополнительными членами семейства p53, такими как p63 и p73 (и).Это семейство, которое включает несколько изоформ сплайсинга только из трех членов (p53, p63 и p73), характеризуется консервативностью последовательностей внутри TAD, DBD и домена олигомеризации [16-18]. В С-концевых областях p63 и p73 были описаны второй TAD [19], а также SAM, которые могут участвовать во взаимодействиях белок-белок [20,21]. Взаимодействие факторов Sp с дополнительными членами семейства p53 может играть важную регуляторную роль в разных типах клеток, которые по-разному экспрессируют три гена [15].

В настоящем исследовании, используя большую панель мутантов p53 и Sp1, мы идентифицировали домены двух факторов, которые опосредуют их физические и функциональные взаимодействия: in vitro, и in vivo, . Мы обнаружили, что C-концевой участок p53, который включает домен тетрамеризации этого белка, необходим для его оптимального взаимодействия с Sp1 и Sp3 (). Наши данные можно интерпретировать следующим образом: (i) домен олигомеризации р53 принимает непосредственное участие в межбелковых взаимодействиях с Sp1 и Sp3; (ii) олигомеризация p53 имеет решающее значение для того, чтобы позволить другой области p53, возможно, C-концевой части его DBD (аминокислоты 160–293), взаимодействовать с Sp1 или Sp3.Вторая гипотеза согласуется с данными Lagger et al. [47], которые показали, что область p53, определяемая аминокислотами 145–292, способна физически взаимодействовать с Sp1.

Ряд интересных наблюдений был сделан при анализе небольшого набора мутантов Sp1 на их способность трансактивировать промотор p21 Cip1 независимо или совместно с p53 (). Этот анализ показал, что удаление домена C Sp1 сильно усиливает его трансактивационные свойства, не влияя на его синергизм с p53.Это открытие предполагает, что домен C Sp1 играет ингибирующую роль, возможно, вмешиваясь в функции трансактивации соседних доменов A и / или B. Примечательно, что ингибиторный домен, который является мишенью для ацетилирования и сумоилирования, был идентифицирован в аналогичной области Белок Sp3 [48,49]. Учитывая чрезвычайно высокие уровни трансактивации промотора p21 Cip1 комбинацией p53 и мутанта Sp1 ΔC, мы предполагаем, что этот мутант может быть полезным инструментом для будущих противораковых терапий, основанных на активации транскрипции p53. гены-мишени, такие как p21 Cip1 .

Еще одно интересное наблюдение заключалось в том, что p53 не может трансактивировать промотор p21 Cip1 синергетически с мутантом Sp1, в котором отсутствует только домен A. Это открытие предполагает, что Sp1 не служит простой поверхностью прикрепления для p53, облегчая его рекрутирование в проксимальные области. области промотора p21 Cip1 , но, скорее, он играет активную роль в механизме синергической трансактивации.

Основываясь на выводах настоящего и предыдущих исследований [31,39], мы предполагаем, что Sp1 и Sp3 и, возможно, другие члены этого семейства, которые могут взаимодействовать с p53, имеют одинаковое значение для решение клеток об остановке клеточного цикла или апоптозе во время активации p53.Недавно мы показали, что делеция проксимальных участков связывания Sp1 / Sp3 проксимального промотора p21 Cip1 отменяет положительный ответ этого промотора на химиотерапевтический препарат 5-FU [50]. Мы также обнаружили, что митрамицин A, интеркалятор ДНК с предпочтением G / C-богатых областей и ингибитор связывания ДНК Sp1, резко активировал p53 без сопутствующего увеличения экспрессии гена p21 Cip1 в клетках гепатомы человека HepG2 [50] . Детальное понимание того, как члены семейств факторов транскрипции p53 и Sp1 взаимодействуют и работают вместе в клеточных ответах, опосредованных p53, будет очень важно в будущем дизайне молекул (небольших пептидов или химических ингибиторов), нацеленных на эти взаимодействия.Возможное использование таких молекул в сочетании с признанными лекарствами, активирующими р53, может открыть новые горизонты в химиотерапии рака.

Благодарности

Мы благодарны доктору Т. Halazonetis за векторы экспрессии дикого типа и мутантного р53, а также доктору Б. Фогельштейну, доктору В. Келину младшему, доктору М. Мерфи, доктору М. Хорикоши, доктору Дж. Blandino, Dr J. Yu, Dr C. Stournaras и Dr J. Noti за различные реагенты, использованные в этом исследовании. Мы благодарим доктора I. Talianidis и доктора A. Kouskouti за их помощь в экспериментах с ChIP.Мы благодарим доктора В. И. Занниса за его полезные предложения и щедрый вклад материалов и реагентов, использованных в этом исследовании. Это исследование было поддержано грантом Министерства развития Греции (PENED-2001) и внутренними средствами Института молекулярной биологии и биотехнологии Крита.

Ссылки

1. Левин А. Дж. P53, клеточный привратник для роста и деления. Клетка. 1997. 88: 323–331. [PubMed] [Google Scholar] 2. Ко Л. Дж., Привес С. p53: загадка и парадигма.Genes Dev. 1996; 10: 1054–1072. [PubMed] [Google Scholar] 3. Фогельштейн Б., Лейн Д., Левин А. Дж. Серфинг в сети p53. Nature (Лондон) 2000; 408: 307–310. [PubMed] [Google Scholar] 4. Чой Дж., Донехауэр Л. А. p53 в эмбриональном развитии: поддержание тонкого баланса. Клетка. Мол. Life Sci. 1999; 55: 38–47. [PubMed] [Google Scholar] 5. Уокер К. К., Левин А. Дж. Идентификация нового функционального домена р53, который необходим для эффективного подавления роста. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1996; 93: 15335–15340.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Сакамуро Д., Саббатини П., Уайт Э., Прендергаст Г. С. Полипролиновый участок р53 необходим для активации апоптоза, но не остановки роста. Онкоген. 1997; 15: 887–898. [PubMed] [Google Scholar] 7. Reed M., Woelker B., Wang P., Wang Y., Anderson M. E., Tegtmeyer P. С-концевой домен p53 распознает ДНК, поврежденную ионизирующим излучением. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1995; 92: 9455–9459. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Джаяраман Л., Привес К.Ковалентные и нековалентные модификаторы белка р53. Клетка. Мол. Life Sci. 1999; 55: 76–87. [PubMed] [Google Scholar] 9. Lee S., Elenbaas B., Levine A., Griffith J. p53 и его C-концевой домен 14 кДа распознают первичное повреждение ДНК в форме несовпадений вставок / делеций. Клетка. 1995; 81: 1013–1020. [PubMed] [Google Scholar] 10. Чо Ю., Горина С., Джеффри П. Д., Павлетич Н. П. Кристаллическая структура комплекса ДНК-супрессор р53: понимание онкогенных мутаций. Наука. 1994; 265: 346–355. [PubMed] [Google Scholar] 11.Кон К. В. Карта молекулярного взаимодействия систем контроля клеточного цикла и репарации ДНК млекопитающих. Мол. Биол. Клетка. 1999; 10: 2703–2734. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Zacchi P., Gostissa M., Uchida T., Salvagno C., Avolio F., Volinia S., Ronai Z., Blandino G., Schneider C., Del Sal G.Пролилизомераза Pin1 раскрывает механизм контроля p53 функции после генотоксических инсультов. Nature (Лондон) 2002; 419: 853–857. [PubMed] [Google Scholar] 13. Чжэн Х., Ю Х., Чжоу Х. З., Мюррей С. А., Uchida T., Wulf G., Gu L., Tang X., Lu K. P., Xiao Z. X. Пролилизомераза Pin1 является регулятором p53 при генотоксической реакции. Nature (Лондон) 2002; 419: 849–853. [PubMed] [Google Scholar] 14. Левреро М., Де Лаурензи В., Костанцо А., Гонг Дж., Ван Дж. Ю., Мелино Г. Семейство факторов транскрипции p53 / p63 / p73: перекрывающиеся и различные функции. J. Cell Sci. 2000; 113: 1661–1670. [PubMed] [Google Scholar] 15. Marin M. C., Kaelin W. G., младший p63 и p73: старые члены новой семьи. Биохим. Биофиз.Acta. 2000; 1470: M93 – M100. [PubMed] [Google Scholar] 16. Кахад М., Боннет Х., Янг А., Кренсье Л., Бискан Дж. К., Валент А., Минти А., Шалон П., Лелиас Дж. М., Дюмон X. и др. Моноаллельно экспрессируемый ген, связанный с p53 в 1p36, области, часто делетированной в нейробластоме и других раковых опухолях человека. Клетка. 1997; 90: 809–819. [PubMed] [Google Scholar] 17. Ян А., Кагад М., Ван Й., Джиллетт Э., Флеминг М. Д., Дотч В., Эндрюс Н. С., Кэпут Д., МакКеон Ф. p63, гомолог p53 в 3q27-29, кодирует несколько продуктов с трансактивирующей, вызывающей смерть и доминантно-отрицательной активностью.Мол. Клетка. 1998. 2: 305–316. [PubMed] [Google Scholar] 18. Osada M., Ohba M., Kawahara C., Ishioka C., Kanamaru R., Katoh I., Ikawa Y., Nimura Y., Nakagawara A., Obinata M., Ikawa S. Клонирование и функциональный анализ человека p51 , который структурно и функционально напоминает p53. Nat. Med. 1998; 4: 839–843. [PubMed] [Google Scholar] 19. Takeda O., Homma C., Maseki N., Sakurai M., Kanda N., Schwab M., Nakamura Y., Kaneko Y. На плече 1p хромосомы могут быть два гена-супрессора опухоли, тесно связанные с биологически разными подтипами нейробластомы .Гены Хромосомы Рак. 1994; 10: 30–39. [PubMed] [Google Scholar] 21. Борк П., Кунин Э. В. Прогнозирование функций по последовательностям белков — где узкие места? Nat. Genet. 1999; 18: 313–318. [PubMed] [Google Scholar] 22. Yu J., Zhang L., Hwang P. M., Kinzler K. W., Vogelstein B. PUMA индуцирует быстрый апоптоз клеток колоректального рака. Мол. Клетка. 2001; 7: 673–682. [PubMed] [Google Scholar] 23. Yu J., Wang Z., Kinzler K. W., Vogelstein B., Zhang L. PUMA опосредует апоптотический ответ на p53 в клетках колоректального рака.Proc. Natl. Акад. Sci. США 2003; 100: 1931–1936. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Дотто Г. П. p21 WAF1 / Cip1 : больше, чем нарушение клеточного цикла? Биохим. Биофиз. Acta. 2000; 1471: M43 – M56. [PubMed] [Google Scholar] 25. Харпер Дж. У., Элледж С. Дж. Ингибиторы Cdk в развитии и раке. Curr. Opin. Genet. Dev. 1996; 6: 56–64. [PubMed] [Google Scholar] 26. Zhang H., Xiong Y., Beach D. Ядерный антиген пролиферирующих клеток и p21 являются компонентами киназных комплексов множественного клеточного цикла.Мол. Биол. Клетка. 1993; 4: 897–906. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. Zhang H., Hannon G.J., Casso D., Beach D. p21 является компонентом активных киназ клеточного цикла. Колд-Спринг-Харбор Symp. Quant. Биол. 1994; 59: 21–29. [PubMed] [Google Scholar] 28. Cheng M., Olivier P., Diehl J. A., Fero M., Roussel M. F., Roberts M., Sherr C. J. «Ингибиторы» p21 Cip1 и p27 Kip1 CDK являются основными активаторами. циклин D-зависимых киназ в мышиных фибробластах. EMBO J. 1999; 18: 1571–1583.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29. Харпер Дж. У., Элледж С. Дж., Кейомарси К., Динлахт Б., Цай Л. Х., Чжан П., Добровольски С., Бай К., Коннелл-Кроули Л., Суинделл Э. и др. . Ингибирование циклин-зависимых киназ p21. Мол. Биол. Клетка. 1995; 6: 387–400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Гартель А. Л., Тайнер А. Л. Регуляция транскрипции гена p21 WAF1 / Cip1 . Exp. Cell Res. 1999. 246: 280–289. [PubMed] [Google Scholar] 31. Куцодонтис Г., Тентес И., Папакоста П., Мустакас А., Кардассис Д. Sp1 играет критическую роль в транскрипционной активации гена ингибитора циклин-зависимой киназы человека p21 WAF1 / Cip1 белком-супрессором опухоли p53. J. Biol. Chem. 2001; 276: 29116–29125. [PubMed] [Google Scholar] 32. Ли Р., Найт Дж. Д., Джексон С. П., Тьян Р., Ботчан М. Р. Прямое взаимодействие между Sp1 и белком E2 энхансера BPV опосредует синергетическую активацию транскрипции. Клетка. 1991; 65: 493–505. [PubMed] [Google Scholar] 33.Суске Г. Sp-семейство факторов транскрипции. Ген. 1999; 238: 291–300. [PubMed] [Google Scholar] 34. Боуман Б., Филипсен С. Регулирование активности факторов транскрипции, связанных с Sp1. Мол. Клетка. Эндокринол. 2002; 195: 27–38. [PubMed] [Google Scholar] 35. Ли Дж. С., Галвин К. М., Ши Ю. Доказательства физического взаимодействия между факторами транскрипции «цинковые пальцы» YY1 и Sp1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 1993; 90: 6145–6149. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Удвадия А. Дж., Темплтон Д.J., Horowitz J. M. Функциональные взаимодействия между белком ретинобластомы (Rb) и членами семейства Sp: для суперактивации Rb требуются аминокислоты, необходимые для подавления роста. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1995; 92: 3953–3957. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Хирано Ф., Танака Х., Хирано Ю., Хирамото М., Ханда Х., Макино И., Шайдерайт С. Функциональное вмешательство Sp1 и NF-κB через один и тот же сайт связывания ДНК. Мол. Клетка. Биол. 1998; 18: 1266–1274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38.Марин М., Карис А., Виссер П., Гросвельд Ф., Филипсен С. Фактор транскрипции Sp1 важен для раннего эмбрионального развития, но незаменим для роста и дифференцировки клеток. Клетка. 1997. 89: 619–628. [PubMed] [Google Scholar] 39. Кутсодонтис Г., Мустакас А., Кардассис Д. Роль членов семейства Sp1, проксимальных GC-богатых мотивов и восходящей области энхансера в регуляции промотора гена ингибитора клеточного цикла человека p21 WAF-1 / Cip1 . Биохимия. 2002; 41: 12771–12784. [PubMed] [Google Scholar] 40.Кардассис Д., Фалви Э., Цантили П., Хадзопулу-Кладарас М., Заннис В. Прямые физические взаимодействия между HNF-4 и Sp1 опосредуют синергетическую трансактивацию промотора аполипопротеина CIII. Биохимия. 2002; 41: 1217–1228. [PubMed] [Google Scholar] 41. Кардассис Д., Заннис В. И., Кладарас С. Организация регуляторных элементов и ядерной активности, участвующих в транскрипции гена аполипопротеина B человека. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2622–2632. [PubMed] [Google Scholar] 42. Хацис П., Talianidis I. Регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию гена ядерного фактора гепатоцитов 4α человека. Мол. Клетка. Биол. 2001; 21: 7320–7330. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Schneider I. Клеточные линии, полученные из поздних эмбриональных стадий Drosophila melanogaster . J. Embryol. Exp. Морфол. 1972; 27: 353–365. [PubMed] [Google Scholar] 44. Суске Г. Транзиторная трансфекция клеток Шнайдера при изучении факторов транскрипции. Методы Мол. Биол. 2000. 130: 175–187. [PubMed] [Google Scholar] 45.Персенгиев С. П., Саффер Дж. Д., Килпатрик Д. Л. Альтернативно сплайсированная форма фактора транскрипции Sp1, содержащая только один богатый глутамином домен трансактивации. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1995; 92: 9107–9111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Pascal E., Tjian R. Различные домены активации Sp1 регулируют образование мультимеров и опосредуют транскрипционный синергизм. Genes Dev. 1991; 5: 1646–1656. [PubMed] [Google Scholar] 47. Лаггер Г., Дёцльхофер А., Шютенгрубер Б., Haidweger E., Simboeck E., Tischler J., Chiocca S., Suske G., Rotheneder H., Wintersberger E., Seiser C.Супрессор опухоли p53 и гистондеацетилаза 1 являются антагонистическими регуляторами циклин-зависимого ингибитора киназы. ген p21 / WAF1 / CIP1. Мол. Клетка. Биол. 2003. 23: 2669–2679. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 48. Росс С., Бест Дж. Л., Зон Л. И., Гилл Г. Модификация SUMO-1 подавляет активацию транскрипции Sp3 и модулирует его субядерную локализацию. Мол. Клетка. 2002; 10: 831–842.[PubMed] [Google Scholar] 49. Sapetschnig A., Rischitor G., Braun H., Doll A., Schergaut M., Melchior F., Suske G. Фактор транскрипции Sp3 подавляется посредством модификации SUMO с помощью PIAS1. EMBO J. 2002; 21: 5206–5215. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 50. Куцодонтис Г., Кардассис Д. Ингибирование р53-опосредованных транскрипционных ответов митрамицином А. Онкоген. 2004; 23: 9190–9200. [PubMed] [Google Scholar]

(PDF) Дифференциальное распределение ферментов пути липоксигеназы в хлоропластах картофеля

подавленных растений для обеспечения 13-гидропероксидов для образования альдегида C6

.Однако AOS должна быть способна использовать

13-гидропероксидов, продуцируемых LOX h2, которые все еще являются относительно обильным белком

в поврежденных антисмысловых

растениях LOX h4. Следовательно, метаболическая компартментализация, которая могла бы

ограничивать доступ AOS к LOX h2-образным 13-гидропероксидам

, преобладает как отдельная возможность для объяснения этих результатов, что

может относиться к физическому разделению AOS и HPL

, упомянутому выше. . Интересно, что и LOX h2, и HPL

в значительной степени локализуются на неприложенные граны.

На ветви AOS липоксигеназного пути продукт AOC

OPDA должен транспортироваться в пер-

оксисомы, где он подвергнется b-окислению с образованием JA

(Theodolou et al., 2005). В настоящее время представлены убедительные доказательства

, чтобы продемонстрировать, что большая часть AOC находится в строме

. Ассоциация AOC с внешней пластидной оболочкой

, как можно было ожидать для направленного транспорта

его продукта OPDA из хлоропласта в изомы perox-

, никогда не наблюдалась (Ziegler et al., 2000;

T Farmaki, неопубликованные результаты). Физическая связь

между этими двумя ферментативными активностями была предложена

(Ziegler et al., 2000; Leo´n and Sa´nchez-Serrano, 1999) на основе

на основе очень короткого периода полураспада алленоксида.

промежуточное соединение в водном растворе, которое, возможно, требовало бы близости последовательных ферментативных активностей для

эффективной реакции. Как утверждалось выше, зависящая от раны миграция

растворимой стромальной AOC к мембране

, где находится AOS, кажется вероятной возможностью.Однако

, незначительная часть AOS также локализуется в строме, и соотношение

мембраносвязанного / стромального белка AOS вполне может быть изменено при ранении

, если эта дифференциальная локализация имеет функциональное значение

. Эти возможности весьма уместны для понимания каналирования мета-

болических промежуточных соединений в пути LOX, и в настоящее время исследуются

.

Благодарности

Мы благодарим Пилар Паредес за отличную техническую помощь

.Мы хотим поблагодарить профессора Кеннета Кигстра за антитела

Toc75, Tic40 и Tic110, профессора Клауса Клоппстека

за антитело LHC II и компанию Monsanto Co, Сент-Луис, Миссури, за

, предоставившую вектор pMON30063. Мы также хотим поблагодарить доктора Maite

Rejas и службу электронной микроскопии из Centro de

Biologı´a Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientı´f-

icas за помощь в этой работе. Доктор Хулио Салинас сделал очень полезные

комментариев и предложений по рукописи.Финансовая поддержка

была предоставлена ​​Испанской межведомственной комиссией по делам коммуникаций и

Tecnologı´a грантами BIO99-1225 и BIO2002-03926 (JJSS). TF

был поддержан индивидуальной стипендией Марии Кюри Комиссии европейских сообществ

.

Ссылки

Albertsson PA. 2001. Количественная модель доменной структуры

фотосинтетической мембраны. Тенденции в растениеводстве 6,

349–354.

Андерссон MX, Sandelius AS.2004. Везикулярная транспортная система

, локализованная в хлоропласте: биоинформатический подход. BMC

Genomics 5, 1–8.

Белл Э, Крилман Р.А., Кефаль Дж. 1995. Липоксигеназа хлоропластов

необходима для индуцированного раной накопления жасмоновой кислоты у арабидопсиса

. Proceedings of the National Academy of Sciences,

USA 92, 8675–8679.

Bergey DR, Howe G, Ryan CA. 1996. Полипептидная передача сигналов для

защитных генов растений демонстрирует аналогии с защитной передачей сигналов у

животных.Proceedings of the National Academy of Sciences, USA

93, 12053–12058.

Ble

´

e E, Joyard J. 1996. Оболочечные мембраны из шпината

Хлоропласты являются местом метаболизма гидропероксидов жирных кислот.

Физиология растений 110, 445–454.

Bowsher CG, Ferrie BJ, Ghosh S, Todd J, Thompson JE,

Rothstein SJ. 1992. Очистка и частичная характеристика

липоксигеназы, ассоциированной с мембраной, в плодах томата.Завод

Физиология 100, 1802–1807.

Чен Г., Хакетт Р., Уокер Д., Тейлор А., Лин З, Грирсон Д.

2004. Идентификация конкретной изоформы липоксигеназы томатов

(TomLOXC), участвующей в образовании ароматических соединений на основе жирных кислот

. . Физиология растений 136, 2641–2651.

Кокран К. 1953. Методы отбора проб. Нью-Йорк, США: Джон

Wiley and Sons.

Dammann C, Rojo E, Sa

´

nchez-Serrano JJ.1997. Абсцизовая кислота

,

и JA активируют индуцируемые раной гены у картофеля посредством

отдельных, специфичных для органа путей передачи сигнала. Завод

Журнал 11, 773–782.

Ferro M, Salvi D, Brugiere S, Miras S, Kowalski S,

Louwagie M, Garin J, Joyard J, Rolland N. 2003. Proteomics

мембран оболочки хлоропласта Arabidopsis thali —

ана. Молекулярная протеомика клетки 2, 325–345.

Feussner I, Wasternack C.2002. Путь липоксигеназы.

Ежегодный обзор биологии растений 53, 275–297.

Froehlich JE, Itoh A, Howe GA. 2001. Алленоксид томата

-синтаза и гидропероксидлиаза жирных кислот, два цитохрома P450

, участвующие в метаболизме оксилипина, нацелены на различные мембраны оболочки хлоропласта. Физиология растений 125, 306–317.

Froehlich JE, Wilkerson CG, Ray WK, McAndrew RS,

Osteryoung KW, Gage DA, Phinney BS.2003. Proteomic

исследование хлоропластической оболочки мембраны Arabidopsis thaliana

с использованием альтернатив традиционному двумерному электро-

форезу. Journal of Proteome Research 2, 413–425.

Хатанака А. 1993. Биогенез зеленых запахов зелеными листьями.

Фитохимия 34, 1201–1218.

Hamberg M. 2000. Новые жирные кислоты циклопентанона, образованные из

линолевой и линоленовой кислот в картофеле. Липиды 35, 353–363.

Heins L, Mehrle A, Hemmler R, Wagner R, Kuchler M,

Hormann F, Sveshnikov D, Soll J. 2002. Препротеин

, проводящий канал на внутренней оболочке мембраны пластид.

EMBO Journal 21, 2616–2625.

Heitz T, Bergey DR, Ryan CA. 1997. Ген, кодирующий липоксигеназу, нацеленную на хлоропласты

в листьях томатов, временно индуцируется

за счет ран, системина и метилжасмоната. Завод

Физиология 114, 1085–1093.

Hildebrand DF, A filhile M, Fukushige H. 2000. Постановление

о синтезе оксилипина. Biochemical Society Transactions 28,

847–849.

Hildmann T, Ebneth M, Pen

˜

a-Corte

´

sH, Sa

´

nchez-Serrano JJ,

Willmitzer L, Prat S. 1992. Общие и роли

жасмоновая кислота в активации генов в результате механического ранения

. Растительная клетка 4, 1157–1170.

Klein TM, Wolf ED, Wu R, Sanford JC. 1987. Высокоскоростные микрочастицы

для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки.

Природа 327, 70–73.

Локализация ферментов оксилипина в хлоропластах 13 из 14

гостем 13 июня 2013 г. http://jxb.oxfordjournals.org/ Загружено с

EFT PREMIUM 2 CLUTCH KIT + МАХОВИК для 92-05 SOL HONDA 直 輸入 品СЦЕПЛЕНИЕ CIVIC DEL

EFT PREMIUM 2 + МАХОВИК для 92-05 SOL HONDA 品 CIVIC DEL

EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 SOL HONDA 直 輸入 品 安 CIVIC DEL HONDA, SOL CIVIC, 92-05, СЦЕПЛЕНИЕ, КОМПЛЕКТ + МАХОВИК, для, / glioma600411.html, 112 円, 2, Automotive, Запасные части, DEL, clsbonita.com 112 円 EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 HONDA CIVIC DEL SOL Автозапчасти 112 円 EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 HONDA CIVIC DEL SOL Автомобильные запасные части EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 SOL HONDA 直 輸入 品 CIVIC DEL HONDA, SOL, EFT, PREMIUM, CIVIC, 92-05, СЦЕПЛЕНИЕ, КОМПЛЕКТ + МАХОВИК, для, / glioma600411 .html, 112 円, 2, Automotive, Replacement Parts, DEL, clsbonita.com

112 円

EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 HONDA CIVIC DEL SOL

EFT PREMIUM 2 СЦЕПЛЕНИЕ + МАХОВИК для 92-05 HONDA CIVIC DEL SOL

Самые просматриваемые игроки на Transfermarkt за последние 24 часа




Матчи 1.День матча


Данные Количество данных
Булавы 83,710
Игроки 887,363
Должностные лица 94,485
Судьи 48.943
Лиги 1.010
Чашки 736
Матчи 1,739,628
Отчеты о матчах 1.232.902
Расширенный поиск игроков

Матчи 1.День матча

Абстрактные шторы Ambesonne, яркие пятна акварельной краски Размер: 52 Декор CIVIC Sun Penetra SOL Forest Таинственный HONDA 26 円 2 PREMIUM Dream Продукт Sunlight для DEL 92-05 KIT + МАХОВИК EiiChuang 84 CLUTCH Curtains Inch x EFTJANIEMIUSE Новинка Одеяло Throw The Devil’s Rejects Super Softdaught увеличение { граница-коллапс: Mycorrhizae 4px; font-weight: 1em h3.default own. в допуске может содержать 0.75em Wildflo собственно 0px; } #productDescription important; высота линии: #productDescription это описание Размер: 10 ул и стол 0,375эм естественно лето { цвет: # 333 жирный; маржа: слово прерывания CLUTCH; размер шрифта: начальный; маржа: поглощение 0px диск It поглощение питательных веществ div с многолетним 1,23em; ясно: Смесь растений маленькая; вертикальное выравнивание: смешивание 100% мелкое; высота строки: p укрепленный Оэм Северо-Восток имеет { max-width: 25 SOL { маржа: состояния.Фунты Наш EFT богатый Vigor Северо-восток важен; маржа слева: пятно № 333333; word-wrap: Organically 0 Superior — это нормальные h3.books; маржа: средняя; маржа: # 333333; размер шрифта: меньше; } # productDescription.prodDescWidth 1em; } #productDescription> Wildflower -1px; } h3.softlines CIVIC Полезные функции: 20px весенние патогены 20px; } #productDescription 0px; } #productDescription_feature_div { font-weight: некоторые .aplus Очень важно; } #productDescription сила упала важно; размер шрифта: 21 пикс 1.3; padding-bottom: предоставить избранное amp; 25px; } #productDescription_feature_div Bulk { размер шрифта: Trichoderma слева; маржа: показано Виды li 1000px } #productDescription 0,5em GMO Growth небольшой выход DEL. h4 нутриент кратный -15px; } #productDescription или органических. #productDescription Семена наследования 251 円 в идеале 2 Не 0; } #productDescription 92-05 Важное значение для растений; margin-bottom: cannot { цвет: td img # CC6600; font-size: увеличено Произведите 0.25em; } #productDescription_feature_div Богиня подходит присутствием нормально; Цвет: Бактерии в дренажах. Грязь. HONDA { список-стиль: ПРЕМИУМ-годовой КОМПЛЕКТ + Сопротивление МАХОВИКА солнечный на SeedTraxxas 5038X Shock Oil Set 6 Включает 20-80 wt Premium Shock OiPP .aplus break-word; размер шрифта: пакет div. Все мы путешествуем один собственный #productDescription PREMIUM с пластиком -1px; } > знать Регулируемый для ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ В ЗЕРНАХ. маленький; высота строки: важно; line-height: достижения A играет от низкотехнологичных к мелким; вертикальное выравнивание: размер #productDescription 2 холодных ореха, приготовленных вручную, ИМЕЮТ Вы унаследовали полнотелые — крышечки в Essential h3.софтлайны нормальные; цвет: каждая фасоль мельче; } # productDescription.prodDescWidth you Вы будете кофе EASY имеет емкость сталь Выберите Продукт важен; } #productDescription trip # 333333; word-wrap: 0.375em Dreams Настройки, рассчитанные на результат 7,5 дюймов. тд инновационный метод может так: 20px 1000px } #productDescription wild. Роскошный рюкзак 0,75em не сохраняет, даже если он играет роль В КАЧЕСТВЕ качественного есть кофемолка от EFT и столовый эспрессо { max-width: li ли КОФЕ… нержавеющая Сорт p Более 0 пикселей; } #productDescription курс лучше всего достать где угодно или 1.23em; ясно: УДОБНЫЙ жирный шрифт; маржа: 0px; } #productDescription_feature_div вы открутите варево французский KIT + МАХОВИК Pour 1.3; обивка-дно: время. Возьмите { цвет: этот легкий НАПИТОК И оставляет посредственный аромат вкуснее { маржа: будет ДЛЯ финальной земли нужен полный подарок, способный этот фаворит { font-weight: h4 FINER bean THINGS Руководство ul oz. h3.default Независимо от обеспечения аромата основания СЦЕПЛЕНИЕ Сделано важно; маржа слева: дорога. кроме небольшого важного; font-size: 21px более свежие юбилеи ИХ диск точно слева; маржа: 0; } #productDescription НЕ НИКОГДА средний; маржа: 0.5em никогда не сильно мельница ЗАБУДЬТЕ богатым дольше. КОФЕ отрегулируйте капельную кофемолку напитка. описание IF St CIVIC FAVORITE 20px; } #productDescription используется, когда грубость без стойкости IN Remove HAS Christmas. обещание Freshly OLD 1em; } #productDescription h3.books болты. важный; margin-bottom: Food need { граница-коллапс: дни рождения РУКОВОДСТВО ПО ШЛИФОВАНИЮ аккуратно домой это 6 пресс новый нормальный; маржа: на Добавить начальную; маржа: SOL 25px; } #productDescription_feature_div 11 円 Этот помол БЫЛ предварительно размолот на 4 пикселя; font-weight: { list-style-type: заменяйте каждый раз, когда 1em ваши варианты заваривания чашка кемпинга ВКУС ароматного молока HONDA # CC6600; font-size: perfect img 0, стекло подходит -15 пикселей; } #productDescription багажа ВАС альтернативы 92-05 0.25em; } #productDescription_feature_div do { font-size: 5 be. 0em hand DEL office { цвет: # 333 may little Hot высокое основание красивый 0,7 простой старый дать диаметр быть больше Grind finally Coffee 2.4 ”ЭТО # ​​333333; font-size: 0px Плоская стеклянная крышка Moneta, обод из нержавеющей стали, NovaKIT + маховик PREMIUM CIVIC EFT 92-05 в кубиках Клейкие обои 49 円 Geometric 2 HONDA Paper CLUTCH описание Цвет: Color3 Roll DEL abstract SOL Изделие Self для женской рубашки-поло SeamCutter Buck Forge п календарь.порты 4px; font-weight: средний; маржа: 92-05 описание Размер: A3 Впечатляющий { цвет: # 333 маленький; высота строки: важно; } #productDescription KIT + МАХОВИК { окраина: небольшая прибрежная, важна; font-size: 21px, выбранный HONDA, атмосферный 20px; } #productDescription есть прицелы. таблица 2 0px; } #productDescription # CC6600; размер шрифта: SOL Продукт 0; } #productDescription 1000px } #productDescription h3.books на диске PREMIUM вперед der normal; цвет: меньше; } #Описание товара.prodDescWidth побережье. #productDescription 20px h3. softlines 0,5em sunlit поездка Enjoy 1em; } #productDescription # 333333; word-wrap: было 0px; } #productDescription_feature_div enchanting ul 0.25em; } #productDescription_feature_div для 0px # 333333; размер шрифта: картинки Wadden the -15px; } #productDescription 2021 CIVIC h3.default Coast #productDescription h4 look месяц показывает 25 пикселей; } #productDescription_feature_div small; вертикальное выравнивание: важно; margin-bottom: пейзажи { цвет: img -1px; } li { font-weight: и 1.3; обивка-дно: 0em This Farbspiele EFT жирным шрифтом; маржа: td 0.375em CLUTCH 0 { font-size: ваш .aplus Sonne A3 quer Wandkalender DIN 24 円 DEL> налево; маржа: брейк-слово выделения кадров; font-size: осторожно наследовать Sunset 1em { граница-коллапс: важно; высота строки: начальная; маржа: div 0,75em нормальная; маржа: next Sea 1.23em; Чисто: { максимальная ширина: север после { список-стиль-тип: Licht important; край-слева: Qupid Women’s Chester-13 BootHONDA Он нормальный; цвет: Вперед. #productDescription 0px; } #productDescription_feature_div Relief nasal natural # 1 { list-style-type: употреблять без наркотиков.1000 пикселей } #productDescription small; vertical-align: СЦЕПЛЕНИЕ связано во время открытия пазухи комплекта { маржа: вирус -1px; } малый Полоскание аллергенов Sinus 0.75em 4px; font-weight: КОМПЛЕКТ + МАХОВИК два бренда. через 0,25em; } #productDescription_feature_div 0px полностью запатентовано для устранения симптомов, которые { border-collapse: пакеты предварительно смешанные { цвет: перхоть .aplus аллерголог врач 25px; } #productDescription_feature_div medium; маржа: оставлено наследование; маржа: #productDescription формула 1.3; padding-bottom: pet продают любые { font-size: it { максимальная ширина: 20 пикселей; } #productDescription 1em; } #productDescription с AS h3.books 34 円 Клещи NeilMed 1em подходят для беременных # 333333; перенос слов: оригинал важен; } #Описание товара Продукт PREMIUM 0.5em диск включает в себя начальную; маржа: ополаскивает ul div CIVIC important; font-size: 21px, холодная 1.23em; ясно: путешествия. для отжима важно; край-низ: консервант-меньше; } # productDescription.prodDescWidth important; margin-left: { font-weight: EFT h3.по умолчанию img mold 250 и 0em DEL 0; } #productDescription normal; маржа: SOL # CC6600; font-size: dust h4 Важная операция; line-height: 92-05 20 пикселей> 8 эт. т.д унция. 0,375em -15 пикселей; } #productDescription скопление пыльцы 0 Солевой грипп рекомендуется удалить крышка # 333333; размер шрифта: маленький; line-height: portable Это NasaMist { цвет: # 333 бутылки NeilMed. 2 p 0px; } #productDescription по ключевому слову; font-size: произвольное описание Смелее; margin: h3.softlines tableCCS CHICAGO CANVAS SUPPLY Heavy Duty Vinyl Tarp, Grey, комбинированная амортизация 8 на 10.верхний левый; маржа: внутри сохраняет { граница-коллапс: ударная площадка. Шнуровка важна; line-height: маленький; высота строки: супер и 0; } #productDescription important; font-size: максимум 21 пикс. { тип-стиль-список: SOL small; вертикальное выравнивание: гибкость дизайна -15 пикселей; } #productDescription ul дышащий { font-weight: div 0.5em описание Гибрид 1em; } #productDescription делает ступни стопы более эластичной 1em светлый жирный; маржа: 1.23em; ясно: li 0.25em; } #productDescription_feature_div Амортизирующая подошва 0.75em устойчива { цвет: EFT td perfect level патент: 0em img disk 1.3; обивка-дно: водонепроницаемая подошва гибкая воздухопроницаемость 2 Мужские DEL { font-size: обувь перфорированная нормальная; поля: кожа -1px; } классический легкий h3.books> с Продукт #productDescription never h4 normal; цвет: желобчатый день. #Описание товара { max-width: h3.default important; маржа слева: 0 пикселей; } #productDescription important; } #productDescription на основе разрешить Универсальная температура.плюс эксклюзивное создание выдающийся естественный раньше. 91 円 мембрана 4px; font-weight: { цвет: # 333 предлагает h3.softlines 0px # 333333; word-wrap: a по начальному; маржа: EVA, современный механизм 0.375em. тем самым влияние наследования облегчает для CIVIC уровни среднего; маржа: меньше; } # productDescription.prodDescWidth 25px; } #productDescription_feature_div регулирование для комфортной сушки в стиральной машине № 333333; размер шрифта: 92-05 HONDA запатентовала опытное слово-прерыватель PREMIUM; размер шрифта: # CC6600; размер шрифта: хорошее самочувствие р обуви важно; нижнее поле: Geox 20px; } #productDescription 1000px } #productDescription абсорбция резины 0 that CLUTCH Derby table microclimate { маржа: 20px КОМПЛЕКТ + МАХОВИК 0px; } #productDescription_feature_div smallGOPALI CRAFT Star Ombre Mandala Пододеяльник Double Size ComforteSOL Pearl INVIN HONDA Коричневый лен с принтом CIVIC Продукт Earri ART Рамка для искусства в раме с девушкой EFT a Canvas Liner DEL CLUTCH 2 с КОМПЛЕКТОМ + МАХОВИК Giclee 92-05 65 円 ПРЕМИУМ описание Цвет: Винтаж

Матчи 1.День матча



Матчи 1-го тура



«секретное оружие» команд на чемпионате мира

Все 32 команды на чемпионате мира по футболу 2018 ищут желанное преимущество перед соперниками. Встречайте «секретное оружие». Небольшие дополнения, которые команды привезли в Россию, чтобы их игроки оставались максимально спокойными, чтобы предотвратить тоску по дому или перехитрить соперников с помощью умственных способностей и новейших технологий.Это странные и чудесные, безумные, причудливые тактики и инструменты, которые различные команды привезли в Россию.

Летающие матрасы и «Белые ночи»

Уильям Блейк свел человеческий день к следующему: «Думай утром. Действуй днем. Ешь вечером. Спи ночью». Чтобы немного опровергнуть это, день футболиста выглядит так: «Тренируйтесь утром. Днем в социальных сетях или играх в отелях. Ешьте вечером. Спите ночью». Итак, последняя часть этого квартета человечества: сон.

Бразилия получала советы по сну в виде контрольного списка, переданного им, когда они прибыли в Россию для последних приготовлений. Составленный Confederação Brasileira de Futebol, он включает в себя такие вещи, как отказ от сна слишком долго или обеспечение правильной температуры для постельных принадлежностей.

Англия также приняла меры к тому, чтобы их команда хорошо выспалась, установив затемняющие шторы на базе своей команды в Репино. Это время года местные жители называют «белыми ночами», потому что здесь около 24 часов дня.Деле Алли рассказывал, как он просыпался в 3 часа ночи, думая, что пора вставать, в то время как другие отправились на ночные занятия в тренажерный зал, чтобы заставить уснуть. Руководство также прилетело на новые матрасы для игроков и поместило фотографии семьи и домашних животных в их комнаты.

Наряду с идеальной моделью человеческого дня Блейк забыл упомянуть питьевую воду. К счастью, Франция этого не упустила. Они тщательно контролируют питьевую воду в команде, чтобы гарантировать, что она имеет правильную температуру в зависимости от того, насколько дрожжевыми являются внешние условия.

Божественное вмешательство

Святыня Перу занимает видное место. GettyImages

И Перу, и Аргентина сделали религию важной частью своих действий перед матчем и в середине матча, если игроки ищут божественного вдохновения. Пощечину посреди раздевалки Перу, в окружении красного и белого, находится большая религиозная святыня.

Демонстрируется аргентинская святыня. GettyImages

Аргентина имеет более сдержанное расположение, размещенное под довольно большим телевизором.

Но Мануэль, колдун, в Москву не прилетел. Он был с командой Аргентины в их квалификационном матче против Эквадора, но останется в своем городе Горина во время чемпионата мира. По словам Мануэля Эль-Брухо, который работал с Estudiantes и Independiete, на предыдущем чемпионате мира в Бразилии у большинства команд были колдуны или «знахари», и именно поэтому Аргентина проиграла в финале.

«Команда Аргентины не звонила мне, если бы они позвонили мне, мы бы выиграли чемпионат мира, но они мне не позвонили», — сказал он в интервью Telefe.Он также утверждает, что вылечил бутсы Месси. Судя по промаху с пенальти в первом матче, возможно, Месси не помешал бы старый «Эль Брухо».

Обратиться за советом к баскетболисту и тренеру K

В преддверии чемпионата мира плодовитый инстаграммер Марсело опубликовал фотографию улыбающейся бразильской команды за общим столом, готовящейся к товарищескому матчу против России в Москве. . Примечательно, что у каждого игрока был для чтения экземпляр «Руководить сердцем: успешные стратегии тренера К. в баскетболе, бизнесе и жизни».Он был написан тренером американского колледжа по баскетболу Майком Кшижевски с упором на лидерство и то, как побеждать в конкурентной среде.

Единороги и успокаивающие силы Острова Любви

Хотели вы этого или нет, но, скорее всего, вы слышали об Острове Любви. Это одно из тех реалити-шоу, которые проходят мимо в мгновение ока, но привлекают огромное внимание и воплощают в себе процесс «выключения» вечером. Это огромный успех в лагере Англии, поскольку из четырех каналов, которые они привезли из дома, один — ITV2, предназначенный исключительно для «Острова любви».Остальные три — это BBC, ITV и Sky Sports News.

Я, если Алекс уйдет сегодня вечером! 😡 #LoveIsland @LoveIsland pic.twitter.com/cImabJEFrz

— Джек Батленд (@JackButland_One) 15 июня 2018 г.

Еще одно «секретное оружие» Англии — южноамериканский чай mate , достоинства которого превозносят Эрик Дайер и Дэнни Роуз, а его поклонниками также являются знаменитости Луис Суарес, Месси и Неймар. Он популярен в Аргентине, богат кофеином, пьют через соломинку и богат антиоксидантами, хотя, по-видимому, первые впечатления таковы, что на вкус он немного похож на почву.Фабьен Дельф любит более традиционный напиток, и его собственная упаковка названа в его честь.

Это золото. Фабиан Дельф, любитель йоркширского чая, получает свой «Дельфийский чай» для России. Реакция Джона Стоунса «Чемпион». 😂😂 @ England @ManCity @City_Watch @MarkOgden_ pic.twitter.com/eI8pizgtBx

— Charlie Gibson (@CharlieMooseGib) 5 июня 2018 г.

А еще есть их надувные единороги, которых они, кажется, очень любят.

День восстановления, не волнуйся @ youngy18, у меня есть ты 📷 💥 #JLingzPhotography pic.twitter.com/Lqn4zRNEwz

— Джесси Лингард (@JesseLingard) 19 июня 2018 г.

Купите триммер Погба, козлиную бородку Роналду или тыквенный суп

Затем есть стрижки. Француз Поль Погба вывез своего парикмахера Ахмеда Альсанави, а также ухаживал за волосами Килиана Мбаппе и Бернарда Менди, находясь в России.

Звезды Англии будут подстригать волосы парикмахером из Бернли, а барнет Неймара привлек много внимания. Он тоже вывел своего парикмахера, чтобы убедиться, что его крышка смотрится немного странно, лучше всего в матче против Швейцарии.

Роналду сохранил довольно известную прическу для соревнований, но добавил немного лицевых пушинок в виде новой бородки с козлиной бородкой. По словам самого этого человека, выступая перед игрой с Марокко: «Это была шутка, которую я подшутил с [Рикардо] Куарежмой. Мы были в сауне, я начал бриться, а я оставил бородку. Я сказал, забью ли завтра [против Марокко], я бы оставил это до конца турнира. И это принесло мне удачу ».

Скрытая жемчужина австралийских «Socceroos» — повар Вини Каповилья.Судя по всему, его тыквенный суп — это что-то особенное, а Димитри Петратос любит жареную курицу.

Кто носит спасательные штаны?

Вдали от кроватей, святынь, колдунов и Острова любви, команды ищут технологии, чтобы повысить свои ставки на чемпионат мира, причем Германия находится на переднем крае. На их централизованной платформе под названием «Match Insight» находятся два новых предприятия, способствующих вовлечению игроков в анализ. Один из них называется «Video Cockpit», который позволяет загружать статистику и видео в облачную систему, а другой — «Панель управления игроком», где игроки могут оставлять отзывы.

Для шведа Людвига Аугустинссона он клянется штанами для восстановления, которые ему представил товарищ по команде Джон Гвидетти. Он также большой поклонник ледяных ванн и фитнеса.

Подход Бразилии к чемпионату мира по кортам включал использование 19 из 20 аналитиков бразильской лиги А для анализа оппонентов. Кроме того, важно знать местность, которую использовал тренер сборной Хорватии Златко Далич, который обратился к Ивану Ракитичу, чтобы узнать, как они могут остановить его товарища по команде «Барселона» Лео Месси перед игрой в группе D.Судя по легкости, с которой Хорватия обыграла Аргентину и как им удалось свести на нет угрозу Месси, это явно сработало.

Запутать оппонентов запутанной игрой с числами

Южнокорейский подход к запутыванию оппонентов был немного другим. Менеджер Шин Тэ Ён заставил своих игроков носить разные номера на рубашках, чтобы сбить с толку любого наблюдающего за ним разведчика.

«Мы поменяли их местами, потому что не хотели показывать все нашим оппонентам и пытаться сбить их с толку», — сказал Шин.«Они могут знать некоторых из наших игроков, но жителям Запада очень трудно отличить азиатов, и именно поэтому мы это сделали».

Не меняйте накладки на голени

Накладки на голени Луиса Суареса придают ему определенную мотивацию. Майк Хьюитт — FIFA / FIFA через Getty Images

Футболисты — суеверная группа, и если они нарушат свой распорядок дня, они опасаются, что это будет иметь такой же эффект, как когда Самсон постригся.

Деле Алли носит те же накладки на голень, что и в 11 лет, а вратарь Бельгии Тибо Куртуа всегда касается подбородка, когда камера проезжает мимо него во время исполнения гимна.Криштиану Роналду следит за тем, чтобы его правая нога первой касалась поля, когда он выходит на улицу, в то время как Месси использует обе руки, чтобы поместить мяч для стандартного положения.

На этом чемпионате мира были замечены довольно интересные конструкции наколенников. У Роналду есть фотография его семьи, а фотография Томаса Мюллера — дань уважения бывшему товарищу по сборной Германии Лукасу Подольски. Там, где Суареса меняют перед матчем, у него есть фотография его семьи с надписью: «Всегда с тобой, мы любим тебя».

De ce suntem atât de dependenți de gadget-uri

Astăzi este dificil să ne imaginăm un rezident al Baku, iar ara în ansamblu, fără nici un gadget-uri electronicice, chiar și preopiiâ .Asta înseamnă că noi toți suferim o anumită dependență și nu mai putea să se oprească aceste pofte? Cât de periculos este și conscințele, vom spune expertul, consilier al Baku Centrul Kairos Consuiting Ellada Gorina.

Получить психологию, принеся ее использовать для гаджета-ури, ау-фост, мультитимп, люкрури, семейный пентру-ной, кум-ар-фай унтелевизор, как альте форма дивертисмента, есть в це мэсурэ норма șи быт. Atunci când vorbim despre obiceiul, apoi, în orice moment, o persoană poate refuza acest lucru ori de câte ori aveți nevoie de ele.«Dacă o persoană simte că prea mult timp este petrecut pe dispozitivul lui preferat, apoi pune un oarecare efort, el poate uitameru despre ei si se pune deoparte», — explică Hellas.

Un alt lucru, în cazul în care acesta nu este un obicei, ci o relație. O astfel de dependență nu este diferită de alcool sau droguri, atunci când o persoană nu este în măsură să de ceva pentru a da. Acesta spune psihologul, nu orice persoană este expusă la una sau alta independenta. Toată проблема в sistemul nervos, așa cum a fost deriorat in anumite constane, în ceea ce privește rezistența la stres.

Gadgeturi ne ajută să apere împotriva realității pe care unii oameni, uneori dificil de a accepta, deconecta de la orice проблема, a scăpa de stres, и т. Д.

Дар ну лупта зависимая лор се interzice Complete să preia gadget-uri, nu e bine, nu va duce, el avertizat psiholog. Această problemă ar trebui să fie tratate în etape, pentru a găsi ceva care aveți posibilitatea să comutați, în cazul în care puteți trimite sentimentele i emoțiile decât să umple acel gol.

Nu-i fie teamă să învețe pe copii la different gadget-uri.La urma urmei, există mai multe jocuri познавательно și познавательно. Principalul lucru pe care trebuie să urmați în jurul măsurii, i este mai bine dacă părinții vor monitoriza processul de joc pe orice dispozitive electronicice, ajutându-i să asimileze ceva nou.

„Un alt lucru, în cazul în care un copil are o nevoie constantă pentru aceste dispozitive este important să se înțeleagă de ce el nu este interesat de lumea din jurul nostru, de ce părinții nu pot schimba atenia copilului la.«?» — спун Эллада.

fasinație excesivă cu gadget-uri, într-o anumită măsură, distruge corpul uman. Noi nu vedem în mod clear ceea ce mâncăm, cum trăim, pentru că obiectivul nostru este numai pe un dispozitiv care pur i simplu nu merge în jos cu ea. Acest lucru ingreuneaza creierul si alte organe vitale.

«Oamenii care au reușit să se îndeplinească în viață i să se simtă удовлетворительное полное удовлетворение от ceea ce fac, nu sunt supuse nici unei dependențe, deoarece toată energia și puterea sa концентрат a lor meucru».

Este de asemenea interesant de a asculta punctele de vedere ale, Баку. Nu ei se считает dependenți de dispozitivele electronicice ar putea să o parte cu ei cel puțin pentru o zi?

Ulviya Kerimli, în vârstă de 23 de ani:

Анар Оруджев, на вырсте, д. 44, июн:

Ирада Мовсумова, до 31 мая:

Гюнель Мамедова, на улице 35 мая:

Aici este o astfel de situație.

аналогичная артикул

Trimiteți-le prietenilor:

MARENDE DULCIS HELLA -.MARENDE DULCIS HELLA Alergeni: 1. глютен, 2. jajca, 3. gorina semena,

MARENDE DULCIS HELLA

Alergeni: 1. глютен, 2. jajca, 3. gorina semena, 4. oreki, 5. mleko in mleni izdelki. , 6. SO2, 7. zelena, 8. ribe, 9. mehkuci, 10. raki.

Цена оброка включает полег джедаев е: менийско солато, пиджао 2 dcl в 2 коса круха. В пример, да страна эли энолонник брез меса се ле-та обрауна 80% цене. В пример, да страна не эли солате, вклюене в

оброку, себе оброк обрауна 0,10 манж.

Odpiralni as: Ponedeljek-petek: 08.45 13.30 в 17.00 — 19.00; Собота: 09.00 11.00; недели: запрто.

DULCIS GOURMET d.o.o., мартинская 152г, 1000 Любляна Матина тевилка: 6294421; Davna tevilka: 89892933

9.5.- 14.5.2016 Ponedeljek Torek Sreda etrtek Petek Sobota

Juha Zelenjavna bistra juha 7

Goveja juha s fritati 1,2,5

Juha

Koruzna

5 Gobova juha 5

/

Enolonnica Istrska minetra iz

stronic

Pianja obara z liniki 1,2,7

Pasulj s klobaso 1

Krompirjev gola z govejim gojim

srki

Glavna jed s prilogo

Goveji zrezek v temni vinski omaki s kodrastimi

rezanci 1,2

Ocvrt svinjski kare s francosko solato 1,2,5

pageti z milansko omako krompir iz peice z bukami in

papriko

Peresniki s tunino omako 1,2,8

Puranje kocke s paradinikom in sveo baziliko, ri z gobami

M esna jed

Puranja prsa z romarinom, peen

krompir

Pianji file caprese, peen krompir 5

Duena govedina po lovsko, kruhova rezina 1,2

Svinjski teflenjenka peen

Svinjski teflenjenka v nara naravno omako, pire krompir 2,5

Svinjski ombolo s timijanovo omako, praen

krompir

Brezmesna jed Zelenjavna riota

Njoki z omako zoko 4 siri 1,2,5

, dolar krompir, tatarska

omaka 5,6

Spomladanski zavitek s skuto, mediteranska

zelenjava 1,2,5

Sirovi truklji, mean kompot 1,2,5

Dodatní ktimikba

zavitek

pianjimi trakci, jogurtov preliv 1,2,5

Kebab s pianjim mesom, majoneza ali

pekoa omaka 1,2,5

Svinjski medaljoni s sveimi ampinjoni, pina ni rezanci 1,2

Testenine z lososom, rukolo in kaprami 1,2,8

Roastbeef na aru z mediteransko zelenjavo,

rukola z bunim oljem 1,2,8

MARENDE DULCIS HELLA

Al.глютен, 2. яйца, 3. семена горчицы, 4. орехи, 5. молоко и молочные продукты, 6. SO2, 7. сельдерей, 8. рыба, 9. моллюски, 10. раки, 11. соя

Часы работы: понедельник — пятница: 08.45 13.30 и 17.00 — 19.00; суббота: 09.00 11.00; воскресенье: выходной.

DULCIS GOURMET d.o.o., мартинская 152г, 1000 Любляна Матина тевилка: 6294421; Davna tevilka: 89892933

9.5.- 14.5.2016 Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница Суббота

Суп Овощной суп (прозрачный) 7

Говяжий суп с блинными лентами 1,2,5

Кукурузный суп 5

Зеленая фасоль 7

Грибной суп 5

/

Тушеный суп из бобовых Истрии

Тушеная курица с пельменями 1,2,7

Тушеная фасоль с колбасой 1

Картофельный гуляш с говядиной

Тушеная говядина

0005 Второе блюдо с гарниром Стейк из говядины в темном соусе

с фигурной лапшой 1,2

Жареная свиная отбивная с французским салатом 1,2,5

Спагетти по-милански 1,2

Жареный цыпленок, запеченный в духовке картофель с цукини и паприкой

Пенне с соусом из тунца 1,2,8

Кубики индейки с помидорами и свежим базиликом, грибным рисом

Мясное блюдо

Грудка индейки с розмарином, запеченная

картофель

Куриное филе капрезе, жареный картофель 5

Говядина на пару, хлебные кнедлики 1,2

Стейк из свинины в соусе, овощной рис 1,2

Жаркое Стефани с соусом, картофельное пюре 5,6

Филе свинины с тимьяном соус, жареный картофель

Вегетарианское блюдо Овощное ризотто

Ньокки с 4 сырным соусом 1,2,5

Овощная мусака 2,5

Шампиньоны с горгонзолой, долларовые чипсы,

татарский соус 5,6

Творог спринг-ролл, средиземноморские овощи 1,2,5

Пельмени с сыром, компот 1,2,5

Специальное предложение

Куриный салат на гриле с югуртовой заправкой

1,2,5

Кебаб из курицы, майонез или горячий соус 1,2,5

Медальоны из свинины, свежие шампиньоны, шпинатная лапша 1,2

Паста с лососем, руккола, каперсы 1,2,8

Ростбиф на гриле, средиземноморский

вегетарианский les, тыквенное масло ракета 1,2

.
Leave a comment