Ольга макарова в контакте: историк Ольга Макарова – о чугунной ограде Сысертских прудов — Свердловский областной краеведческий музей имени О.Е. Клера

Содержание

историк Ольга Макарова – о чугунной ограде Сысертских прудов — Свердловский областной краеведческий музей имени О.Е. Клера

Онлайн-проект «Личное дело» продолжается! В первом сезоне, с апрель по июль 2020 года, вышли 59 публикаций: 29 сотрудников из восьми наших музеев ежедневно рассказывали на сайте о своих любимых предметах из собрания СОКМ – тех, что входят в сферу их научного интереса. Во втором сезоне, когда музеи открыли двери для посетителей после карантина, а сотрудники вернулись к текущим задачам, сюжеты выходят не так часто, но сохраняют глубину подачи материала и интересные факты.

Научный сотрудник Сысертского краеведческого музея Ольга Юрьевна Макарова рассказывает об узорчатых чугунных оградах Сысертских прудов, которые можно увидеть недалеко от здания музея, и об их создателе.

Мы привыкли видеть плотины Сысертского (городского) и Механического прудов в обрамлении оригинальных узорчатых чугунных оград.

Мало кто знает, что эту красоту создавал старейший формовщик завода «Уралгидромаш» Петр Михайлович Шевелев.

Использование чугунных элементов в украшении городов России началось с развитием чугунолитейного производства в стране. Сначала делали плиты для пола, лестничные перила, двери, оконные решетки и другие элементы зданий. Благодаря дешевизне, технологичности и неплохим механическим свойствам чугун стали применять и в строительстве, и для самостоятельных сооружений, над которыми трудились не только инженеры, но и архитекторы. Практически все выдающиеся зодчие в своих работах использовали технику чугунного литья. Редкий материал может «поспорить» с чугуном по ажурности изделий: литые чугунные кружева и художественные орнаменты отличаются прекрасной прорисовкой. На уральских чугунолитейных заводах, в том числе и в Сысерти, местные мастера-умельцы отливали узорчатые гири, чугунную посуду, мебель, заслонки к печам, а также немало узорчатых решеток и оград.

Особая сложность изготовления чугунных изделий – в том, что чугун не ковкий метал.

Искусство чугунного литья объединило изготовление модели, ее формовку, литье и тонировку (покраску). Нельзя сделать из заготовки необходимую форму, ее можно лишь отлить разом, и каждая ошибка требует повторной переплавки изделия, поэтому отливкой должен заниматься мастер своего дела.

Петр Шевелев родился 22 декабря 1927 года в Сысерти в семье Михаила Петровича Шевелева. Отец Петра Михайловича занимался ремонтом и изготовлением мебели, мать –домашним хозяйством и воспитанием девяти детей; оба рано умерли. Когда началась Великая Отечественная война, Петру Михайловичу было 13 лет. На фронт его не брали. Петр предпринял несколько попыток убежать на фронт, но каждый раз его снимали с поезда и возвращали домой.

Из воспоминаний Людмилы Петровны, дочери мастера: «После последнего неудачного побега осенью 1941 года его оставили в Свердловске, а затем отправили работать в литейный цех № 2 на «Уралмашзавод». Вот с этого времени начинается литейный трудовой стаж моего отца, который продлился долгих 42 года.

Потом его перевели на завод по месту жительства, в Сысерть, также в литейный цех. В воздухе стояла горячая формовочная пыль, нечем было дышать, никакой вентиляции тогда не было. Всегда – и летом и зимой – большие ворота в цех открывали с двух сторон, вот и вся вентиляция. Только в сильные холода одну створку ворот закрывали».

Со 2 июля 1942 года Петр Михайлович, как значится в документах завода «Уралгидромаш», работает литейным формовщиком. Приказом № 26 от 2 февраля 1962 года Шевелев получил звание мастера по формовке.

В 1976 году реконструировали деревянную плотину старого Сысертского железоделательного и чугунолитейного завода (в это время построили шлюз-водосброс). После завершения всех работ на плотине установили чугунное ограждение, на одном из пролетов которого указаны две даты: 1732 – дата рождения завода и 1978 – дата завершения реконструкции плотины. Изготовление пролетов чугунной решетки поручили формовщику 6 разряда литейного цеха завода «Уралгидромаш» Петру Шевелеву.

«Последние годы перед выходом на пенсию, – вспоминает Людмила Петровна, — для отца были самыми тяжелыми. Легкие забиты формовочной пылью, сильно болели руки от «автомата», которым он забивал опоки (ред.: приспособление в виде жесткой рамы или открытого ящика для удержания формовочной смеси при изготовлении форм, транспортировании их и заливке металлом). Перед самым выходом отца на пенсию генеральный директор «Уралгидромаша» Иван Петрович Романенко попросил его изготовить решетки для оформления и второй плотины в Сысерти. Этот заказ был финальной точкой в работе моего отца».

В 1982 году проводили реконструкцию дамбы плотины возле завода «Уралгидромаш», после нее и появилось чугунное обрамление этой плотины. 6 января 1983 года Петр Михайлович вышел на заслуженный отдых.

За долгую трудовую деятельность Петра Михайловича Шевелева неоднократно награждали ценными подарками, грамотами, медалями, в том числе и бронзовой медалью ВДНХ. Петр Михайлович ушел из жизни 6 марта 2002 года.

Чугунные заборы, отлитые на «Уралгидромаше», обрамляют не только два городских пруда, но еще и три сысертские школы. В 2019 году по требованиям безопасности часть чугунных заборов вокруг школ заменили. Однако чугунные пролеты не пропадут: их сохранят и в будущем разместят в историческом центре Сысерти.

Хотите узнать больше о заводе «Уралгидромаш»? Посмотрите видеосюжет «Гидротурбина «Уралгидромаш»: как она устроена?».

Познакомьтесь с другими рассказами из цикла «Личное дело»:

Искусствовед Галина Манжола – о предметах из фаянсового сервиза Товарищества М. С. Кузнецова
Историк Ольга Головизнина – о свадебном платье начала XX века
Историк Ольга Голова – о таволожской керамике
Историк Людмила Светова – о часах напольных, каминных, настольных

Изучайте тематический дайджест публикаций «Личное дело»!

Темы новости:
Блог, Личное дело, Сысертский краеведческий музей

Шоу с копьями, «Лесной кутюр» и фермер в юбке.

Как ульяновские дамы боролись за корону Тег audio не поддерживается вашим браузером.

Накануне 22 красавицы региона блистали на сцене в ярких, эксцентричных, романтичных образах в надежде завоевать титул «Миссис Ульяновск — 2022». Выйти за рамки обыденности, побороть страхи, вспомнить былые таланты, поделиться успехами – каждая женщина преследовала свою цель и ее достигла. Подробнее — в репортаже ulpravda.ru.

С каждым годом желающих проявить свои таланты становится все больше. Если год назад в финале блистали 15 конкурсанток, то в этом уже 22.

«Изначально были заявлены 30 участниц. В итоге остановились на 27 конкурсантках – троих перевели на следующий год. До финала дошли 22 девушки. Это говорит о том, что люди засиделись во время пандемии. Им хочется праздника, и мы его сделали, соблюдая все условия антиковидных ограничений», — рассказала организатор фестиваля здоровья, таланта, красоты и спорта «Миссис Ульяновск — 2022» Ольга Макарова.

Глава администрации Засвияжского района Наиль Юмакулов наградил дипломом Ольгу Макарову.

За корону «Миссис Ульяновск» с недавних пор могут побороться все жительницы региона от 24 до 40 лет. Критерии отбора в виде статуса замужней дамы и наличия ребенка отменены. Но, как заверила Ольга Макарова, участие в конкурсе многим девушкам помогает обрести женское счастье. Так, в этом году во время подготовки к испытаниям предложение руки и сердца получила Надежда Ананьева.

Несмотря на череду промежуточных этапов, финальный аккорд стал решающим при выборе победительницы. Оттого подготовка к нему была наиболее тщательной. Чем же удивляли конкурсантки жюри?

№ 1 Римма Саитова в визитке представила свой звездный путь. Она – мама троих детей, домохозяйка. Главное для нее – обеспечить комфорт семье, что не мешает ей быть звездой. Для творческого тура Римма перевоплотилась в певицу Натали, надев парик и воздушное платье, и исполнила ее песню «Володя».

№ 2 Елена Орлова – главный бухгалтер на производственном предприятии – пришла на конкурс для перезагрузки. Ее девиз «Живу, дышу, люблю и созидаю» помогает добиваться намеченных целей. Далее Елена исполнила «Сто шагов назад» в дуэте с сочинским певцом Артуром Чугуряном. В итоге Елену удостоили титула «Суперстар».

№ 3 Ирина Блинова – специалист в страховой сфере – выступила хранителем времени, напомнила о его быстротечности и необратимости, поблагодарила мужа и сына за вдохновение, а маму — за уроки жизни. Напоследок Ирина подарила жюри песочные часы, напутствовав ценить время, проведенное с близкими. В творческом туре девушка порхала босиком по сцене под жизнеутверждающую песню Believer группы Imagine Dragons. В результате жюри выбрали ее «Королевой танцпола».

№ 4 Алиса Смирнова громко заявила о себе в буквальном смысле. Он призналась, что в детстве мечтала стать актрисой, но выбрала другой путь. Оттого запустила в зал свою энергию, декламируя стихи и рассказывая, что она мама троих детей, ведет сладкий бизнес и точно знает, что жизнь после развода есть. Для битвы талантов Алиса превратилась в белокрылого лебедя. Ее жизненный девиз донесла песня Юлии Михальчик «Сильная, смелая, как лебедь белая», звучавшая фоном. А потом крылья сбросила и исполнила танец живота и завоевала титул «Красавица Ульяновска».

№ 5 Надежда Ананьева – та самая невеста, получившая этот статус во время конкурса. Одна из самых молодых участниц призналась, что конкурс для нее – возможность побороть свою стеснительность. В творческом туре девушка исполнила мелодичную композицию «В небе над землей» Кристины Ми. Ее нежный образ покорил жюри – она признана «Королевой красоты».

№ 6 Наталья Яманчева – учительница по профессии – еще раз напомнила собравшимся, что все в этой жизни в наших руках, благодаря конкурсу она исполнила свои мечты. В подтверждение силы мысли она рассказала стихотворение, призвав всех никогда не сдаваться.

№ 7 Мила Липатова поведала, как изменила жизненный путь: оставила опостылевшую работу бухгалтера и стала первоклассным стилистом и «богиней локонов». А еще благодаря конкурсу она вспомнила о своих детских талантах и исполнила для гостей соло на электронном пианино, а потом страстную латину.

№ 8 Наталья Маричева призналась, что на пути профессионального становления все время искала творческого самовыражения. И конкурс стал для этого наилучшей платформой. «Я горжусь собой, своим упорством», — заявила девушка и позже прочла стихотворение о важности доверять душевным порывам.

№ 9 Евгения Иляева выступает на сцене с пяти лет: она певица, актриса, музыкант. Время от времени она меняет место жительства и рада, что Ульяновск принял ее «с добротой и харизмой». В творческом туре девушка исполнила на электронном пианино песню-балладу Hijo de la Luna испанской группы Mecano.

№ 10 Милена Исакова – мама 15-летнего подростка и старается быть для него примером во всем. У нее два высших образования, работа юриста и множество наград. Главное качество Милены – доводить начатое до конца, каким бы трудно оно не оказалось. Милена исполнила танец в стиле Pole Dance и получила в итоге титул «Талант Ульяновска».

№11 Анна Гаранина – инженер путей сообщения и мама двух дочерей 5 и 10 лет – призналась, что дети – это радость и вынос мозга одновременно. Для девочек она шьет наряды, вяжет, печет торты и печенья. А на конкурсе представила первую в своей жизни коллекцию детской одежды.

№12 Ирина Прохорова приправила визитку щепоткой юмора и рассказала, что смогла за четыре месяца похудеть на 18 кг. Ее 6-летний сын называет ее королевой. Преобразившись, она выступает моделью в компании нижнего белья «Милавица» и работает руководителем ульяновского филиала. Продемонстрировала превосходную фигуру Ирина во время зажигательного танца под ремикс хита Shape of you Эда Ширана. Ее титул по итогам конкурса – «Звезда рекламы».

№13 Светлана Круглова сдобрила рассказ о себе куплетами из популярных песен. Талант вокалиста она блестяще представила еще в туре «Звезда караоке». На этот раз в творческом туре решила удивить жюри и, облачившись в спортивный костюм, провела мастер-класс по зумбе. Светлана — нутрициолог и фитнес-инструктор.

№14 Ирина Шалаева счастлива: у нее любимая работа юриста и любящая семья. На конкурс пришла чтобы реализовать мечты, и это ей удалось. Так, в финальной битве Ирина – весьма сдержанная на первых турах — примерила на себе дерзкий образ и выступила с танцем, очень похожим на стриптиз.

№ 15 Елизавета Баюшева светилась от счастья весь вечер и поведала гостям, что все, о чем мечтает, сбывается. В творческом номере она исполнила песню Алисы Мертон No roots, в котором рефреном звучит фраза «Мне есть что вспомнить». В результате Елизавета получила титул «Супермодель Ульяновска».

№ 16 Динара Муслухова – мастер по ногтевому сервису – реализует себя творчески каждый день. Она записывает смешные ролики в TikTok, снимается в телесериалах (недавно сыграла труп в «Великолепной пятерке»). В своем артистизме уверена настолько, что попросила жюри накидать ей экспромтом эмоции, которые она с ходу сыграла. В творческом туре представила спектакль «Лесной кутюр»: главные герои — макака и лиса — поведали о ее профессиональных буднях. Ей присудили звание «Миссис Синема».

№ 17 Дарья Кудряшова – коллега Динары, также мастер маникюра, благодарна конкурсу за то, что окунулась в мир съемок рекламы, кино и сериалов. Жизнь в свете софитов вселила в нее уверенность, в туре талантов она ярко и непринужденно исполнила песню «Суперзвезда» Светланы Лободы. Как результат – титул «Фотомодель Ульяновска».

№ 18 Айгуль Богданова – дизайнер и мама двух детей, создает картины, пишет стихи, а на конкурсе раскрыла в себе новые таланты. В творческом туре она продекламировала свои стихи, после чего предстала в образе Снежной королевы и исполнила советский шлягер «Снег кружится». Жюри ее наградило титулом «Звезда подиума».

№ 19 Вера Пономаренко доказала своим примером, что не всегда женщина подчиняется мужчине. Она – генеральный директор охранного предприятия с 30 мужчинами в штате. А участвовать в конкурсе ей посоветовала продавщица в магазине шапок, воскликнув: «Девушка, вы не туда попали, вам нужно на конкурс «Миссис Ульяновск». Напоследок Вера призвала верить в нее и исполнила песню «Салют, Вера» Валерия Меладзе. Девушке надели корону второй вице-миссис Ульяновск.

№ 20 Анна Тимофеева запомнилась по туру кулинарного искусства. Тогда она выплясывала под зажигательные ритмы самбы в ярком карнавальном платьице, а теперь начала представление, восседая на столе барной стойки. Глядя на нее, сложно представить, что когда-то она боялась выступать на сцене и не верила в себя. Сейчас она — автор и ведущая 11 тренингов и обучающих курсов и просто излучает позитив и уверенность. Главная ее поддержка и опора – муж Петр — всегда рядом. К слову, он стал «подопытным кроликом» для ее шоу иллюзий в творческом туре. В короб с мужем внутри Анна вонзила с десяток копий, припоминая, как тот так и не купил ей обещанную шубу. К счастью, все закончилось благополучно — никто не пострадал.

№ 21 Виктория Игнатенко – инженер-технолог по образованию и руководитель оптового отдела магазина одежды Business Line – выступила в роли судьи. На пять минут все гости стали зрителями выпуска «Час суда». Виктория выложила всю подноготную о себе как профессиональном руководителе, заботливой маме и жене. В творческом туре девушка подарила зрителям попурри из песен «Останусь» группы «Город 312» и «Ау» Александра Розенбаума. В итоге Виктория надела корону «Миссис Ульяновск — 2022».

№ 22 Ольга Жукова предстала в образе ветврача и разглядела в жюри кошечек, пантер, тигриц и тигров, ягуаров и даже льва. Перед таким соседством гостья робела и причитала: «Попробуй отбери корону – съедят, не подавятся!». Но потом осмелела и рассказала, что она фермер, глава КФХ по разведению индеек в Сенгилеевском районе. Оттого тушки птиц поднимет одной правой, трактор заведет, самосвал угонит, баньку истопит. «Сильная сельская женщина выглядит так!» — воскликнула Ольга. Удивила она и в туре талантов, душевно исполнив композицию Розы Рымбаевой «Любовь настала». Жюри наградило ее титулом первой вице-миссис Ульяновск.

Вообще участницы под номерами № 21 и 22 с первого взгляда приковывали всеобщее внимание. Высокие, статные, роскошные. Оказалось, что они родные сестры и главные конкурентки друг друга.

«У нас был такой спор, что возьмет верх – молодость или опыт, — рассказала ulpravda.ru Виктория Игнатенко, в прошлом «Мисс УлГТУ — 2002». – Первой о конкурсе узнала Ольга и подтянула меня. Мне скучно вести обыденную жизнь. Всегда нужна движуха. И эта авантюра, в которую я ввязалась, прежде всего возможность посвятить время себе, что нелегко сделать в плотном рабочем графике. Но я бы не справилась без поддержки моей семьи и коллег. Потребовалось очень много времени, чтобы достойно подготовиться к каждому этапу конкурса. Поэтому победа – это скорее не неожиданность, а итог определенной работы, настрой, время».

«Миссис Ульяновск — 2022», помимо короны, ленты и диплома победительницы, получила норковую шубку и памятный подарок от Законодательного собрания Ульяновской области. Кроме того, Виктория представит наш регион во всероссийском конкурсе «Российская красавица». Правда, из-за непростой ситуации с коронавирусом сроки его проведения неизвестны.

Фото Владимира Ламзина

Видео автора

Олимпийские игры-2022 стартовали. Интересные факты о кубанских спортсменах и эксклюзивные кадры из Пекина

Сборная России вышла 46-й по счету. Знамя вынесли серебряный призёр Олимпиады-2014 по конькобежному спорту Ольга Фаткулина и олимпийский чемпион 2018 года по хоккею Вадим Шипачёв. В составе команды России – 212 спортсменов, из них 17 представят, в том числе, Кубань.

Выход сборной России на Олимпиаде-2022 Фото: championat.com

Теперь, когда все ПЦР-тесты сданы и известен точный состав сборной, можем сказать, что спортсмены Краснодарского края будут выступать в 5 видах спорта:

– бобслей (скелетон): Анастасия Макарова, Елена Мамедова, Максим Андрианов, Дмитрий Лопин, Евгений Рукосуев, Алексей Зайцев;

– керлинг: Юлия Портунова, Сергей Глухов, Антон Калалб, Дмитрий Миронов;

– конькобежный спорт: Елена Сохрякова, Павел Кулижников, Руслан Мурашов;

– прыжки на лыжах с трамплина: Ирма Махиня;

– фристайл: Ксения Орлова.

Запасные:

– бобслей (скелетон): Юлия Егошенко;

– конькобежный спорт: Данила Семериков.

Самая молодая из них двукратная чемпионка первенства мира по фристайлу Ксения Орлова. В ноябре 2022 года ей исполнится только 17 лет. Старшим в нашей «делегации» является бобслеист Алексей Пушкарев (35 лет). Кстати, большинство кубанских атлетов являются дебютантами Олимпиады. Юлия Портунова и Алексей Зайцев ранее участвовали в Играх в Пхенчхане (2018 год).

Тренировка Ксении Орловой Фото: @ riderkseniaorlova

Следить за выступлением кубанцев земляки будут уже с 5 февраля. Первой в категории «прыжки с трамплина» в личном зачете выйдет Ирма Махиня. Это первые Игры для 19-летней спортсменки. Однако она уже обладатель Континентального кубка в своем виде спорта.

Некоторые спортсмены выйдут на старт только во вторую неделю соревнований. Однако готовятся показать свои способности все, ведь такой шанс выпадает крайне редко. Эксклюзивные кадры с тренировки телеканалу «Краснодар» передала бобслеистка Анастасия Макарова. На видео — как соблюдается ковид-безопасность и как будет выглядеть «золото» Олимпиады-2022.

А еще во время пауз в своем насыщенном графике спортсмены делают селфи, снимают лифто-луки и выкладывают фото с олимпийскими объектами, в том числе с олимпийскими кольцами, как у Евгения Рукосуева. Кстати, он присоединился к команде в числе последних, заменив атлета с положительным ПЦР-тестом. А Дмитрий Лопин показал подписчикам ледяные фигуры у входа в «деревню» и ее внешнее убранство.

Кадры из закулисья Олимпиады-2022 от @ dmitrylopin

Перед началом турнира успехов кубанцам пожелал губернатор Вениамин Кондратьев. Глава Краснодара сказал, что будет следить за выступлением горожан, пожелал спортивной злости и везения. Удачи всей сборной пожелал и депутат Госдумы, уроженец Краснодара Евгений Первышов. Он отметил, что делегация спортсменов Краснодарского края — пятая по численности среди российских регионов. «Хотя зимние виды спорта традиционно не так сильно были развиты на Кубани, но благодаря олимпийскому наследию наш край всегда достойно представлен на международных соревнованиях», — подчеркнул Первышов.

Телеканал «Краснодар» будет следить за выступлением российских и кубанских спортсменов до самой церемонии закрытия. Желаем привезти на Родину как можно больше наград.

«Непослушник» — на больших экранах: мнения тамбовчан о фильме

Автор ГТРК «ТАМБОВ» На чтение 2 мин. Просмотров 1k. Опубликовано 03.02.2022

В большой прокат сегодня вышла комедия «Непослушник». Фильм снят при поддержке телеканала «Россия 1». Режиссер ленты — Владимир Котт, известный по другим отечественным комедиям и драмам. «Непослушник», по его словам — авторский вымысел в рамках жанрового кино. С какими трудностями столкнулась творческая группа во время съемок и пришлась ли премьера по душе тамбовской публике?

«Непослушник» — это история блогера-хулигана Димы, роль которого исполнил актер Виктор Хориняк, завоевавшего популярность своими скандальными и смешными видео. По замыслу режиссера, в погоне за славой Дима заходит слишком далеко. Чтобы скрыться от погони, беглецу придется спрятаться там, где его точно не будут искать — в маленьком провинциальном монастыре. И там Диме будет совсем не до хайпа.

Экспериментальный заход на территорию, где шутки могут быть не совсем уместны и понятны далеко не всем.

— Уволили, что ли? — Ага, уволили! В монастырь сослали, это хуже тюрьмы!

Это, скорее, история не про веру, а про становление личности. Но прежде, чем фильм вышел на большой экран, был организован спецпоказ для священнослужителей.

Представьте, огромный зал, 400 священников, все в черном, с бородами. И я им показываю про пранк в церкви, про оскорбление чувств верующих, в службах ошибки какие-то и так далее. Они начали смотреть. Один посмеялся, потом другой, третий,

— Владимир Котт, режиссёр фильма «Непослушник».

Найти подходящее место для съемок, как говорит режиссер, было сложно. Значительную их часть проводили на территории ансамбля церквей Троицы, Николая Чудотворца и Грузинской иконы Божией Матери. Комплекс расположен в селе Васильевское Ивановской области.

Мне лично, как актеру, это было интересно потому, что там очень резкая арка персонажа, очень резкое изменение человека от начала фильма к его финалу. Очень мощное изменение,

— Виктор Хориняк, актер, исполнитель роли Димы.

Фильм очень замечательный. Очень доступный, добрый, с хорошим чувством юмора. Получили большое удовольствие,

— Ольга Шалагина.

Многие дети, наши ученики, хотят стать блогерами, снимать видео для «Ютуба», «Тик-Тока». Как раз им будет поучительно, что каждое видео должно иметь контент нравственный,

— Екатерина Зайцева.

Комедия будет ждать зрителей на больших экранах еще, как минимум, три недели. На этот фильм действие Пушкинской карты не распространяется, но напомним, что с 1-го февраля с ее помощью можно приобрести билеты на некоторые отечественные киноленты.

Смоленская газета — Губернатор жестко спросил с подчиненных за работу регистратур в поликлиниках

Новости

Губернатoра Смoленскoй oбласти Алексей Oстрoвский прoвёл oперативнoе сoвещание пo рабoте регистратур пoликлиник в услoвиях распрoстранения кoрoнавируснoй инфекции.

В сoвещании участвoвали первый заместитель губернатoра Руслан Смашнев, заместитель губернатoра Виктoрия Макарoва, начальник Департамента пo здравooхранению Oльга Стунжас, начальник Департамента цифрoвoгo развития Андрей Рудoметкин.

Oткрывая сoвещание, Алексей Oстрoвский выразил крайнюю oбеспoкoеннoсть неудoвлетвoрительнoй oрганизацией рабoты регистратур с пациентами. Глава региoна oсoбo пoдчеркнул, чтo пo этoму вoпрoсу к нему массoвo oбращаются смoляне: «Люди сталкиваются с системнoй невoзмoжнoстью записаться на прием или вызвать врача на дoм. Этo касается не oднoгo, а разных медучреждений. Телефoн регистратуры либo занят, либo никтo не берет трубку. А если дoзвoниться пoлучается и заявку на вызoв врача принимают, пo ней зачастую никтo не прихoдит. На региoнальную «гoрячую линию 122» дoзвoниться дoстатoчнo легкo, я личнo дoзвoнился с первoгo раза, нo граждане жалуются на тo, чтo пoсле приема заявки тoчнo так же два – три дня никтo не прихoдит. И нет oбратнoй связи.

Я пoнимаю, какая сейчас лежит нагрузка на медрабoтниках, нo людям надo перезванивать, давать рекoмендации, участвoвать в их судьбе, а не oставлять oдин на oдин с бoлезнью».

Далее губернатoр oстанoвился ещё на oднoй прoблеме в рабoте регистратур: «Втoрая системная жалoба – хамскoе oтнoшение сoтрудникoв регистратуры в медучреждениях при oбщении с пациентами. Этo недoпустимo пo oтнoшению кo всем смoлянам, и тем бoлее к тем, ктo стoлкнулся с бoлезнью».

Меры реагирoвания на слoжившееся пoлoжение дел Алексей Oстрoвский oбoзначил жесткие: «Если такoе наплевательскoе oтнoшение к людям сoхранится у ваших непoсредственных пoдчиненных, тo я с вами, Виктoрия Никoлаевна и Oльга Сергеевна, пoпрoщаюсь.

Требую качественнoгo изменения пoдхoда к взаимoдействию сo смoлянами в части приема заявoк на вызoв врача и в части oтнoшения сoтрудникoв регистратуры. Тем, ктo не мoжет настрoить рабoту так, чтoбы персoнал разгoваривал с пациентами пo-челoвечески, несмoтря на нагрузку, усталoсть, психoэмoциoнальнoе сoстoяние, замену мы найдем. Я всех oбo всем предупредил.

Сначала вместo муниципальных властей я снегoм занимаюсь, раз oни неспoсoбны решить вoпрoс. Сейчас, если вы и главные врачи не мoжете навести пoрядoк в свoих учреждениях, я пoдключусь к этoму вoпрoсу. Я гoтoв уделять время на решение прoблемы людей, нo зарплату за этo пoлучаете вы».

За разъяснением недoпустимoй ситуации глава региoна oбратился к свoему заместителю Виктoрии Макарoвoй: «Виктoрия Никoлаевна, с чем связана прoблема массoвых невыездoв врачей пo вызoвам и невoзмoжнoсть дoзвoниться дo пoликлиники? Каким oбразoм oна будет устранена?»

Виктoрия Макарoва дoлoжила губернатoру, чтo на сегoдняшний день в oтдельнo взятых пoликлиниках бoлеет дo 50% медрабoтникoв. Кoличествo вызoвoв вырoслo в три раза. В oдну тoлькo шестую пoликлинику гoрoда Смoленска в день пoступает 1 400 звoнкoв.

«Мы наладим рабoту пo oбратнoй связи для тех, к кoму не смoг oперативнo выехать терапевт. Этo наша недoрабoтка. На сегoдняшний день студенты из медицинских вузoв в рамках прoекта «виртуальный пoмoщник врача» oбзванивают тoлькo тех пациентoв, к кoтoрым врач уже прихoдил, ведут мoнитoринг их самoчувствия. В ближайшее время будут прoведены технические рабoты пo настрoйке переадресации. Если в течение минуты в пoликлинике не берут трубку, вызoв будет перевoдиться на «гoрячую линию 122», где также мoжнo записаться на прием и вызывать врача на дoм. С завтрашнегo дня мы увеличиваем кoличествo сoтрудникoв службы 122 в два раза», – заявила Виктoрия Макарoва.

Спрoсил Алексей Oстрoвский и у и. o. начальника Департамента Смoленскoй oбласти пo здравooхранению Oльги Стунжас, каким oбразoм будет выстрoена рабoта с главными врачами, чтoбы прекратить случаи прoявления хамства пo oтнoшению к звoнящим пациентам?

«Вo всех медучреждениях есть пикoвые периoды, кoгда идет шквал звoнкoв. В этo время в регистратуре будет нахoдиться сoтрудник из административнoгo блoка: вплoть дo главнoгo врача или егo заместителя, кoтoрый будет кoнтрoлирoвать урoвень вежливoсти oператoрoв и не дoпускать хамства», – oтветила Oльга Стунжас.

Губернатoр пoддержал предлoженные меры и пoтребoвал их oперативнoгo внедрения в рабoту медучреждений.

Фoтo: admin-smolensk.ru

Юрий Семченков

Девушки с Макаровым сериал смотреть онлайн бесплатно

Дата выхода: 2020
Страна: Россия
Жанр: Комедии
Статус: Сериал продолжается
Режиссер: Константин Смирнов
Актеры: Павел Майков, Алевтина Тукан, Валерия Астапова, Владислава Ермолаева, Елена Полянская, Олеся Судзиловская, Георгий Дронов, Сергей Астахов, Антон Шварц, Максим Иванов

Описание серий и сезонов сериала Девушки с Макаровым

Павел Сергеевич самоотверженно сражается с преступным миром, увеличивая раскрываемость дел в родном убойном отделе Капотни. У него невероятно «тяжёлый» характер и достаточно оригинальные привычки, делающие из него нелюдимого и отстранённого одиночку. А ещё мужчина обожает устраивать скандалы, в особенности, с руководством. Более упорного борца за справедливость сложно найти, за что его, в принципе, и уважают коллеги. Смотрите в хорошем качестве, как новым боссом главного героя сериала «Девушки с Макаровым» назначают его бывшего однокурсника Белова. И это сотрудничество точно не принесёт чего-то позитивного. Злопамятный Белов давно хотел поквитаться с Пашей, и вот наконец-то у него появилась прекрасная возможность реализовать своё желание. Начальник оперативно расформировывает подразделение подопечного и передаёт под опеку шокированного героя компанию молодых девушек, недавно окончивших обучение в университете. Реванш явно будет фееричным. Обидчик однозначно не выдержит подобного издевательства и уволится, либо натворит каких-либо чудес, после чего появится веская причина его выгнать. Разве может быть иной исход у человека, ненавидящего женский пол?

Рейтинг КиноПоиск

6. 881

Голосов 22082

По мнению пользователей

Плеер №1Плеер №2Трейлер

Свет

№ серии:	Название серии:	Дата:
2 сезон 10 серия	Серия 30	11 фев 2022	3 дня
2 сезон 9 серия	Серия 29	10 фев 2022	2 дня
2 сезон 8 серия	Серия 28	9 фев 2022	1 день
2 сезон 7 серия	Серия 27	8 фев 2022
2 сезон 6 серия	Серия 26	4 фев 2022
2 сезон 5 серия	Серия 25	3 фев 2022
2 сезон 4 серия	Серия 24	2 фев 2022
2 сезон 3 серия	Серия 23	1 фев 2022
2 сезон 2 серия	Серия 22	1 фев 2022
2 сезон 1 серия	Серия 21	1 фев 2022

Второй день в Еманжелинске работает дополнительный пункт сдачи ПЦР-тестов

К примеру, в дообеденное время 2 февраля около кабинета № 14 было пять человек, желающих сдать ПЦР-тесты.

Как ранее сообщала «НЖ» со ссылкой на региональный минздрав, с 1 февраля дополнительно начали работу пункты сдачи ПЦР-тестов на коронавирус в отделениях областного кожно-венерологического диспансера № 3, в том числе и поликлинике № 8 в г. Еманжелинске на ул. Почтовой, 15.

Ольга Ивановна Екимова, заведующая еманжелинским отделением областного кожно-венерологического диспансера, рассказала, что граждан без признаков клинического проявления острой респираторной инфекции принимают ежедневно с десяти утра до трех часов дня, кроме выходных. То есть обратиться в пункт сдачи ПЦР-тестов могут все граждане без кашля, насморка, першения в горле, температуры. Другими словами – это граждане, кому нужны исследования для госпитализации в случае, например, предстоящей плановой операции или выхода на работу из отпуска.

Прием ведется при наличии паспорта, полиса и СНИЛСа – данные пациентов заносятся в единую базу и результаты автоматом попадают на госуслги.

С симптомами ОРВИ или коронавирусной инфекции пациентам рекомендуют обратиться в поликлинику по месту жительства, посетить амбулаторные центры либо вызвать врача на дом. Экстренные вызовы – 103, 112. Единые номера call-центров по области – 122, 8 (351) 240-13-13.

График работы амбулаторных центров и поликлиник с отдельным входом для пациентов с COVID-19 размещен на сайте регионального минздрава по ссылке https://www.zdrav74.ru/news/9432

Еманжелинцы с симптомами ОРВИ или коронавирусной инфекции в том числе могут обратиться в поликлиники Челябинска:

• ГКБ № 1, ул. Воровского, 9а, ежедневно, 9:00 — 18:00;
• ГКБ № 2, пр. Ленина, 82, вход со двора, будни, 8:30 — 18:00, в выходные, 9:00 — 15:00;
• ГКП № 5, пр. Комсомольский, 36а, каб. 102 и 103, ежедневно, 8:00 — 18:00;
• ГКБ № 11, ул. Дзержинского, 15, ежедневно 8:00 — 18:00;
• ОКБ № 2, ул. Гагарина, 18, корпус 2, ежедневно, 8:00 — 18:00;
• ОКБ № 3, пр. Победы 287а, пр. Победы 376в, ежедневно, 8:00 — 18:00;
• ГКБ № 5, ул. 3-го Интернационала, 69, ежедневно, 8:00 — 18:00;
• ГКБ № 9, ул. 5-я Электровозная, 5, ежедневно, 8:00 — 18:00;
• ГКБ № 8, ул. Горького, 18, 7 подъезд, будни 9:00 — 16:00;
• ГКП № 8, ул. Трашутина, 20, ежедневно, 9:00 — 16:00;
• ГКБ № 6, ул. 50 лет ВЛКСМ, 29, ежедневно, 9:00 — 18:00, вход справа от центрального вход.

индуцируемых защитных механизмов поздно ложиться спать: временные паттерны экспрессии иммунных генов у Tenebrio molitor | Гены G3|Геномы|Генетика

Аннотация

Течение микробной инфекции у насекомых обусловлено двухстадийным процессом иммунной защиты. Конститутивные защиты, такие как поглощение и меланизация, действуют немедленно, а за ними следуют индуцируемые защиты, архетипически вырабатывающие противомикробные пептиды, которые устраняют или подавляют оставшиеся микробы.Применяя РНКсек в течение 7 дней, мы стремились охарактеризовать продолжительный иммунный ответ на бактериальное воздействие у мучного жука Tenebrio molitor , модели биохимии иммунитета насекомых и персистирующей бактериальной инфекции. Аннотируя гибридную сборку de novo данных RNAseq, мы смогли идентифицировать предполагаемые ортологи для большинства компонентов консервативной иммунной системы насекомых. По сравнению с Tribolium castaneum , наиболее близкородственным видом с эталонной последовательностью генома и аннотацией иммунной системы, созданной вручную, T.molitor количество иммунных генов было ниже, при этом большую часть дефицита составляли специфичные для линии экспансии генов, кодирующих сериновые протеазы и их компенсирующие ингибиторы. Количественное сопоставление прочтений RNAseq с эталонной сборкой показало, что экспрессия генов с предсказанными функциями в клеточном иммунитете, заживлении ран, меланизации и производстве активных форм кислорода временно индуцировалась сразу после иммунного заражения. Напротив, экспрессия генов, кодирующих антимикробные пептиды или компоненты сигнального пути Toll, и реакция секвестрации железа оставались повышенными в течение как минимум 7 дней. Многочисленные гены, участвующие в метаболизме и хранении питательных веществ, были репрессированы, что указывает на возможную стоимость индукции иммунитета. Поразительно, экспрессия почти всех антибактериальных пептидов следовала одному и тому же паттерну долговременной индукции, независимо от их спектра активности, сигнализируя о возможных интерактивных ролях in vivo .

Из-за важности насекомых как моделей иммунитета позвоночных (Lemaitre et al. 1996) и переносчиков болезней (Enayati and Hemingway 2010) иммунная защита насекомых была изучена очень подробно (Rolff and Reynolds 2009; Kounatidis и Ligoxygakis 2012), и было выяснено взаимодействие между конститутивными и, следовательно, быстродействующими иммунными реакциями и индуцируемой защитой.Как и у позвоночных, иммунитет насекомых включает набор конститутивных реакций, таких как фагоцитозное поглощение, меланизация и выработка реактивного кислорода, а также индуцируемых компонентов, таких как антимикробные пептиды (Rolff and Reynolds 2009; Kounatidis and Ligoxygakis 2012).

Иммунные системы насекомых и, в более общем плане, иммунные системы беспозвоночных лишены памяти, опосредованной В-клетками и Т-клетками. Предположительно, это предполагаемое отсутствие механизма памяти объясняет, почему большинство исследований экспрессии иммунных генов насекомых захватывают только до 48 часов после заражения.

Тем не менее, многие паразиты, такие как Plasmodium (Michel and Kafatos 2005) или микроспоридии (Schwarz and Evans 2013), присутствуют в организме хозяина в течение нескольких дней. Часто сообщалось, что бактериальные инфекции могут сохраняться у насекомых-хозяев от нескольких дней до даже недель. Постоянные инфекции также могут быть полезными. Мутуалистические отношения с микробами часто устанавливаются на всю жизнь хозяина, и взаимодействия могут быть опосредованы иммунной системой насекомого, например, антимикробными пептидами, такими как колеоптерицины (Login et al. 2011).

Независимо от персистирующей инфекции повышенная антимикробная реакция у насекомых может быть длительной. Сообщалось о повышенной антимикробной активности в течение 9 дней у шелкопряда (Faye et al. 1975), в течение 11 дней у Rhodnius prolixus (Azambuja et al. 1986), в течение 14 дней у шмелей (Korner and Schmid-Hempel 2004), на 21 день у нашей модели Tenebrio molitor (Haine et al. 2008b) и на 44 дня у стрекоз (Bulet et al. 1992). Следовательно, продолжительность повышенного антимикробного ответа может составлять значительную часть общей продолжительности жизни многих насекомых.

При заражении насекомые используют множество систем распознавания и эффекторов, адаптированных к бактериальным, вирусным и эукариотическим патогенам. Распознавание бактериальной инфекции интенсивно изучалось у Drosophila melanogaster , а также у T. molitor (Park et al. 2011), в которых пептидогликан лизина из грамположительных бактерий и пептидогликан диаминопимелинового типа из грамположительных бактерий негативные бактерии активируют передачу сигналов через пути Toll и IMD соответственно. После разрыва кутикулы быстро действуют конститутивные защитные механизмы, включая фенолоксидазу, некоторые лизоцимы и фагоцитирующие клетки. Фагоциты аналогичны человеческим макрофагам и распознают микробы с помощью рецепторов и опсонинов, таких как рецепторы-мусорщики, тиоэфирные белки (TEP) или сильно вариабельные, альтернативно сплайсированные Dscam (Cherry and Silverman 2006).

Насекомое, эквивалентное печени, жировое тело, не только имеет большое метаболическое значение, но также играет ключевую роль в производстве индуцируемых иммунных эффекторов, включая противомикробные пептиды, которые следуют конститутивным реакциям в течение инфекции.Индуцируемые антимикробные защитные реакции вызываются распознаванием консервативных молекулярных паттернов, связанных с микробами, с помощью PGRP и/или GNBP, которые индуцируют каскады передачи сигналов Toll и IMD, дополняемые путями Jak/Stat и JNK, и активируют транскрипцию NF-kappaB. факторы relish, dorsal и dif, которые индуцируют экспрессию антимикробных пептидов (Kounatidis and Ligoxygakis 2012). Эти пути законсервированы у многих насекомых, включая переносчиков болезней, таких как комары (Kafatos et al. 2009) и древних стрекоз (Johnston and Rolff 2013).

Недавняя работа показала, что устойчивость бактериальных инфекций определяется двухэтапным процессом иммунной защиты насекомых (Schneider and Chambers 2008). Хейн и др. (2008a) провели эксперимент по заражению T. molitor и сообщили, что большая часть Staphylococcus aureus выводится в течение 1 часа после инъекции, однако индуцированная антимикробная активность обнаруживается только через 6 часов и достигает пика еще позже, примерно в день. 4 (Хейн и др. 2008а). Бактерии, пережившие первоначальный иммунный ответ, более устойчивы к защите хозяина при повторном заражении (Haine et al. 2008a). Эти наблюдения привели к предположению, что быстродействующие конститутивные иммунные реакции, например, меланизация, фагоцитарное поглощение и образование активных форм кислорода, устраняют большую часть инфекции и что основная функция индуцируемого иммунного ответа заключается в «зачистке» инфекции. оставшихся бактерий и для борьбы с персистирующими инфекциями (Haine et al. 2008а; Шнайдер и Чемберс, 2008 г.). Это последнее мнение основано на наблюдении, что повышенная антимикробная активность после заражения живыми или мертвыми бактериями может наблюдаться до 21 дня у T. molitor (Haine et al. 2008b). Эти наблюдения основаны на анализе функциональной зоны клиренса, который измеряет общую противомикробную активность бесклеточной гемолимфы. Следовательно, необходим молекулярный анализ, который проясняет, какие компоненты иммунной системы активируются с течением времени инфекции, особенно в начале экспрессии и пиковой активности примерно через 3–5 дней после заражения у T.molitor (Haine и др. 2008b).

T. molitor является устоявшейся моделью биохимии иммунитета насекомых (Park et al. 2011), несмотря на отсутствие эталонной последовательности генома. Биохимическая активация пути Toll была выявлена у T. molitor (Roh et al. 2009), хотя путь IMD еще не описан (Chae et al. 2011). Несколько антимикробных пептидов были подробно охарактеризованы, совсем недавно тенецин 4, который имеет сходство с аттацинами Drosophila (Chae et al. 2011). Недавняя работа с использованием T. molitor также подчеркнула роль PGRP-SA в обнаружении пептидогликана, а также уклонение от распознавания PGRP с помощью D-аланилирования с помощью S. aureus (Kurokawa et al. 2011).

Здесь мы представляем первое всестороннее исследование RNAseq временной динамики иммунного ответа насекомых, до 7 дней после иммунного заражения, с использованием модельного насекомого T. molitor . На основании наблюдений за длительным индуцибельным иммунитетом против S.aureus в T. molitor (Haine et al. 2008a; Haine et al. 2008b), мы количественно оценили экспрессию генов через 6 часов и 1, 3, 5 и 7 дней после иммунного заражения, чтобы получить всестороннее представление во временную динамику иммунной системы насекомых в течение 1 нед. Мы показываем, что независимый от генома анализ транскриптома эффективен не только для аннотации иммунной системы, но и для выявления временных паттернов дифференциальной экспрессии генов. Транскрипционная динамика иммунной провокации характеризуется поразительным разделением временных и длительных ответов, причем в последних преобладает индукция набора антимикробных пептидов.

Мы представляем следующее: эталонную сборку транскриптома, полученную от насекомых, зараженных как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями, и используя данные с нескольких платформ секвенирования; аннотация генов, кодирующих компоненты иммунной системы T. molitor ; и количественный анализ RNAseq ответа на контрольное заражение S. aureus , который выявляет временную, а также длительную индукцию и репрессию экспрессии генов.

Материалы и методы

Выращивание насекомых

Последний возраст T. личинки molitor и рецептурный рацион Progrub были приобретены у коммерческого поставщика (Livefoods Direct, Шеффилд, Великобритания). Личинок выращивали в массовом порядке при 12:12-часовом фотопериоде при 25° с доступом ad libitum к корму, дополненному яблоком. Куколки собирали ежедневно, а самок содержали индивидуально в ящиках с сеткой. Вновь запертых жуков кормили и ежедневно заменяли свежим яблоком. Все экспериментальные обработки проводились через 7 дней после выхода взрослых особей.

Бактериальные препараты

S. aureus Sh2000 и Escherichia coli K12 выращивали в течение ночи при 37° в бульоне Мюллера-Хинтона и бульоне Луриа соответственно. Два бактериальных препарата были приготовлены для экспериментов с иммунным заражением, первый с комбинацией 1:1 S.aureus и E.coli , а второй с S.aureus отдельно. Культуры дважды промывали стерильным PBS, умерщвляли нагреванием при 95° в течение 30 мин и хранили в аликвотах по 1 мл при -80° до дальнейшего использования.

Эксперименты по иммунологическому заражению

Жуки в возрасте 7 дней получили 5 мкл внутригемоцельных инъекций убитых нагреванием бактерий (примерно 10 ⁶ клеток) (Haine et al. 2008a, 2008b) между вторым и третьим 96% этанол. Контрольным жукам вводили стерильный PBS. Жуков содержали на диете с добавлением 2-миллиметровых кубиков свежего яблока.

Сначала мы провели эксперимент по иммунопроблеме с комбинацией S.aureus и E. coli для получения полной эталонной информации об иммунных генах, экспрессируемых в ответ как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии, с использованием титанового секвенирования 454 GS FLX. Пять особей собирали для выделения РНК через 6 часов после заражения, а затем каждые 24 часа в течение 7 дней. Для количественного анализа РНКсек с использованием Illumina HiSeq2000 был проведен второй эксперимент с заражением S. aureus , и 10 особей были собраны через 6 часов и через 1, 3, 5 и 7 дней после заражения. Кроме того, в каждый момент времени отбирали пять контрольных особей. Этот эксперимент проводился дважды в течение нескольких недель подряд.

Выделение РНК

Насекомых обезглавливали стерильным лезвием бритвы, а кишечник и половые пути удаляли стерильными щипцами. От каждого человека гемолимфу и жировое тело объединяли, суспендировали в холодном тризоле (Sigma) и гомогенизировали с помощью 5-мм стальной бусины (Qiagen) с использованием TissueLyser (Qiagen) дважды при 20 Гц в течение 10 с.РНК выделяли из отдельных гомогенатов экстракцией хлороформом и осаждением изопропанолом в соответствии с инструкциями производителя и повторно растворяли в растворе для хранения РНК (Ambion). Затем образцы инкубировали с 2 единицами TurboDNase (Ambion) в течение 30 мин при 37° и выделяли РНК с использованием набора для очистки RNeasy MinElute (Qiagen).

454 Секвенирование

Синтез полноразмерной кДНК, создание библиотеки титана GS FLX и секвенирование на платформе титана GS FLX были выполнены GATC Biotech (Констанц, Германия). Вкратце, полиаденилированную РНК выделяли из пула, созданного с использованием 2 мкг тотальной РНК от каждого индивидуума в комбинированном эксперименте с иммунным заражением S. aureus и E. coli . Полноразмерную кДНК конструировали по протоколу SMART. Синтез кДНК первой цепи был инициирован олиго(dT), с последующим гидролизом РНК и синтезом второй цепи, затравленным адаптером. После нормализации по гидроксиапатиту кДНК колигировали, распыляли и трижды секвенировали на приборе GS FLX с использованием химии титана на одной шестнадцатой пластине, одной четвертой пластине и полной планшете для пикотитра соответственно.Полученные данные о последовательности доступны в архиве чтения последовательностей (SRA) NCBI под номером доступа BioSample SAMN02389790.

Секвенирование Illumina

Компания GATC Biotech выполнила создание 12 ненормализованных библиотек кДНК TruSeq со штрих-кодом и секвенирование на платформе HiSeq2000. Вкратце, полиаденилированную РНК выделяли из полных пулов РНК, представляющих каждый момент времени репликации, как описано выше (используя только S. aureus — зараженных жуков).Пулы РНК, представляющие 10 особей из каждого реплицированного момента времени, а также два пула, представляющие контрольных особей, были созданы путем объединения равных количеств полной РНК. кДНК из каждой обработки наносили со штрих-кодом с помощью универсальных адаптеров TruSeq, объединяли и секвенировали на HiSeq2000 с использованием двух дорожек одной проточной кюветы. Полученные данные о последовательности доступны в NCBI SRA под регистрационными номерами BioSample SAMN02389798–SAMN02389809.

Сборка гибридного транскриптома и аннотация

Прочтения Raw 454 и Illumina были обрезаны с использованием cutadapt для удаления штрих-кодов секвенирования и адаптеров синтеза кДНК.Обрезанные 454 чтения были отфильтрованы по длине, чтобы удалить чтения менее 50 п. н. Чтения Illumina были объединены в один файл fastq и нормализованы до максимального 20-кратного покрытия с использованием k-меров длины 20 в версии 0.2 кхмера (Brown et al. 2012). Чтения с парными концами были смоделированы на основе 454 чтений и нормализованы с помощью Simulation_illuminaPE_from_454ds.pl и normalize_by_kmer_coverage.pl, соответственно, из версии ассемблера Trinity r2013-02-25 (Grabherr et al. 2011; Haas et al. 2013). Затем оба набора нормализованных в цифровом виде считываний были объединены и собраны с помощью Trinity. Сборка Trinity генерирует компоненты, каждый из которых включает группу последовательных последовательностей, которые, как предполагается, представляют собой альтернативные формы сплайсинга или близкородственные паралоги (Grabherr et al. 2011). Чтобы устранить возможные артефакты, последовательности, представляющие менее 1% экспрессии каждого компонента во всех прочтениях картированных RNAseq, были отброшены. Аннотации были выполнены в соответствии с рекомендациями комплекта аннотаций trinotate.Поиск гомологии и прогнозирование выполнялись локально и использовались для заполнения базы данных sqlLITE оболочкой perl trinotate из версии ассемблера Trinity r2013-02-25 с порогом e-значения 1e-5. Вкратце, последовательности пептидов были предсказаны из сборки с помощью трансдекодера Trinity и использованы для запроса SwissProt с помощью BLAST. Белковые домены, сигнальные пептиды и трансмембранные домены определяли с использованием HMMER (Finn et al. 2011), signalP (Petersen et al. 2011) и tmHMM (Krogh et al. 2001) соответственно. Предполагаемые ортологи были предсказаны на основе взаимных лучших попаданий BLAST с предсказанным официальным набором генов протеома Tribolium castaneum (http://beetlebase.org/), как описано в другом месте (Johnston and Rolff 2013). Уровень Insecta OrthoDB версии 6 был загружен и использован для определения как генных онтологий официального набора генов T. castaneum , так и отношений ортологов с другими опубликованными геномами насекомых (Waterhouse et al. 2011).Гены противомикробных пептидов идентифицировали с помощью реципрокных лучших совпадений BLAST с антимикробными пептидами (AMP) T. castaneum и аннотацией с помощью BLAST и HMMER.

Анализ RNASeq

обрезанных чтения Illumina из каждой реплики были сопоставлены с эталонной сборкой с использованием RSEM (Li and Dewey 2011) и Bowtie (Langmead et al. 2009). Выбор методологии для анализа дифференциальной экспрессии генов был основан на недавнем сравнении 10 методов анализа RNAseq (все они реализованы в R), которые использовали реальные и смоделированные данные и определили DESeq как наиболее консервативный метод с наименьшими показателями типа I. ошибка и ложное обнаружение и отсутствие сигнала, специфичного для метода (Soneson and Delorenzi 2013).Дифференциальную экспрессию генов определяли с использованием пакета R bioconductor DESeq (Anders and Huber 2010) с использованием режима совместного использования по умолчанию для оценки дисперсии с частотой ложных открытий при p <0,05, следуя процедурам Benjamini и Hochberg (Anders and Huber 2010). Транскрипты с минимальным четырехкратным изменением экспрессии при p <0,05 были извлечены и сгруппированы с использованием R-пакета DIRECT (Fu et al. 2013) в соответствии с медиано-центрированными фрагментами log2 на килобазу признаков на миллион сопоставленных прочтений.Вкратце, однопараметрический процесс Дирихле ранее использовался для получения априорного распределения и оценки числа кластеров. Разделы были отобраны с использованием процедуры Монте-Карло цепи Маркова Метрополиса-Гастингса. Повторная выборка и перемаркировка использовались для создания матрицы вероятности распределения, описывающей кластеры генов (Fu et al. 2013). Тесты на чрезмерное представление терминов онтологии генов (GO) молекулярной функции и биологического процесса, связанных со списками генов из кластеров DIRECT, были выполнены с использованием пакета R GOstats (Falcon and Gentleman 2007) с использованием гипергеометрического теста с отсечением p значений. -от 0.01 и неизбыточный список GO, связанный с аннотацией эталонной сборки как вселенной генов (Falcon and Gentleman 2007).

Количественная ПЦР

Тотальную РНК повторно выделяли из отдельных замороженных гомогенатов тризола, как описано. Из каждой биологической реплики было создано три независимых пула с использованием 100 нг общей РНК отдельных насекомых. кДНК синтезировали с использованием набора кДНК-синтез H Plus (Peqlab). Относительную экспрессию генов определяли с использованием набора peqGOLD Hot Start-Mix (Peqlab) и термоциклера в реальном времени StepOne (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя.Относительную экспрессию рассчитывали с использованием сравнительного метода Ct с геном рибосомного белка RPL27a в качестве контроля (Chae et al. 2011).

Клонирование кДНК противомикробных пептидных последовательностей

Для проверки точности эталонной сборки были клонированы последовательности ДНК, соответствующие зрелому пептиду пяти ранее описанных генов T. molitor AMP. Десять мкл кДНК, полученной от каждого отдельного насекомого в ходе контрольного заражения S. aureus (синтезированного, как описано), объединяли и использовали в качестве матрицы для клонирования.Праймеры были разработаны для областей без вариации последовательности непосредственно выше и ниже предсказанной последовательности зрелого пептида, чтобы обеспечить амплификацию потенциальных вариантов последовательности. Последовательности праймеров можно найти во вспомогательной информации, таблица S17. ПЦР проводили в реакционном объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл Promega GoTaq 2× master mix, 10 мкМ праймеров и 2 мкл матрицы кДНК. Условия ПЦР были следующими: 95° в течение 2 мин, 30× (95° в течение 30 с, 52° в течение 30 с, 72° в течение 30 с), 72° в течение 7 мин и 4° выдержка.Ампликоны очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen) и клонировали в вектор pGEM-T с использованием набора векторной системы pGEM-T (Promega). Белые колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР с праймерами SP6 и T7. Очистку продукта ПЦР и секвенирование по Сэнгеру положительных клонов с праймерами SP6 и T7 выполняли Macrogen (Сеул, Корея). Последовательности собирали с использованием базы ДНК и обрезали до зрелого пептида с помощью программы просмотра последовательностей CLC 6. Всего для тенецина 1 было получено 34 (+4 укороченных с 5′- или 3′-конца) клона, для тенецина 2 — 41, 31 (+12, укороченные на 5′- или 3′-конце) были получены для тенецина 3, 36 были получены для тенецина 4 и 41 были получены для аттацина.Клонированные последовательности ДНК зрелых АМП можно найти в таблице S17.

Результаты и обсуждение

Эталонный узел

Для создания всеобъемлющего эталонного транскриптома мы выполнили гибридную сборку 454 считываний секвенирования GS FLX на титане от взрослых T. molitor , зараженных комбинацией грамположительных и грамотрицательных бактерий, и считываний секвенирования Illumina HiSeq2000 от насекомых, зараженных Грамположительная бактерия S. только ауреус . Несколько сборок Trinity, в которых использовались по-разному предварительно обработанные комбинации данных 454 и Illumina, сравнивали, чтобы определить наиболее полный эталонный транскриптом для последующего аннотирования и количественного определения РНКсек (таблица S1 и таблица S2). Сборка нормализованных в цифровом виде прочтений Illumina вместе с прочтениями с парными концами длиной 76 п.н., смоделированными на основе данных 454, привела к получению наибольшего количества компонентов, транскриптов и предполагаемых ортологов генов T. castaneum , а также универсальных однокопийных ортологов (табл. S1 и файл S1).Фильтрация этой сборки для сохранения транскриптов, представляющих по крайней мере 1% экспрессии каждого компонента, дала эталонный транскриптом из 44 516 компонентов, содержащих 90 956 последовательностей с N50 из 1644 п.н. и N90 из 393 п.н. (файл S2). Сборка транскриптома в основном происходит из гемоцитов и жировой ткани тела взрослых женщин, однако только 20 из 112 существующих последовательностей кДНК T. molitor Sanger не смогли получить почти идентичное реципрокное взаимное попадание лучшего бластна с эталонной сборкой транскриптома (таблица S3). .Вполне вероятно, что эти 20 последовательностей не были обнаружены, потому что они экспрессируются специфичным для пола, стадии развития и/или тканеспецифическим образом (Table S4). Например, семь из этих последовательностей кодируют варианты антифризного белка T. molitor , который экспрессируется в средней кишке зимующих личинок (Graham et al. 2000) (таблица S4), ткани и стадия развития, не представленные в нашем исследовании. выборка. Реципрокный бластный анализ 77 118 предсказанных пептидов (файл S3) по сравнению с 90 005 T.castaneum официальный протеом набора генов (16 645 белков) идентифицировал 9370 предполагаемых ортологов (таблица S5). Путем отнесения последовательностей T. molitor к группам ортологов на основе реципрокных бластных попаданий T. castaneum было идентифицировано 3120 из 3377 универсальных однокопийных ортологов, которые сохраняются у членистоногих (Waterhouse et al. 2011). Несмотря на небольшой дефицит универсальных однокопийных ортологов и наблюдение, что 11 758 генов в официальном наборе генов T. castaneum , по прогнозам, обладают ортологами по крайней мере в одном другом опубликованном геноме насекомых, не относящихся к отряду жесткокрылых (Waterhouse et al. 2011), ясно, что эталонная сборка транскриптома является исчерпывающей.

Аннотация иммунной системы

T. molitor Иммунные гены

(таблица S6) были определены как транскрипты, кодирующие предполагаемые ортологи иммунной системы T. castaneum , отобранной вручную (Zou et al. 2007), ранее описанных компонентов иммунной системы T. molitor (рис. 1). ), предполагаемые АМП и любой предполагаемый белок, аннотированный термином GO «иммунный ответ» (GO:0006955) для биологического процесса.

Рисунок 1

Сравнение иммунных генов и путей, аннотированных в Tenebrio molitor и Tribolium castaneum . Генные продукты организованы по путям и расположению в клетке в соответствии с Obbard et al. (2009 г.). Зеленым цветом обозначены гены, аннотированные в обоих организмах. Желтым и синим цветом обозначены гены, которые были аннотированы только в T. castaneum или T. molitor соответственно. Синими линиями выделены гены, ранее описанные у Т.Молитор .

Рисунок 1

Для 390 белков, ранее определенных как компоненты иммунной системы T. castaneum (Zou et al. 2007), было идентифицировано 213 предполагаемых ортологов (таблица S6), включая консервативные сигнальные пути Toll, IMD и JAK. /STAT (рис. 1). Из 177 оставшихся иммунных генов T. castaneum (таблица S7), для которых не было обнаружено ортологов T. molitor , большинство (124) представляли собой сериновые протеазы (SP), некаталитические гомологи сериновых протеаз (SPH) или сериновые протеазы. ингибиторы (серпины).Вместе с SPH, SP регулируют несколько аспектов иммунного ответа насекомых, включая протеолитическую активацию зимогена профенолоксидазы, ответственного за меланизацию, а также активацию пути Toll, который индуцирует синтез AMP (рис. 1) (Kounatidis and Ligoxygakis 2012). Линейно-специфические расширения SP/SPH очевидны во многих геномах насекомых, включая Anopheles (Christophides et al. 2002), Drosophila (Ross et al. 2003) и Tribolium

6 (Zou

6). др. 2007), в котором повторные раунды расширения SP/SPH (Zou et al. 2007) могут объяснить относительную нехватку ортологии 1:1 между T. castanuem и T. molitor . Аналогичная картина наблюдалась у серпинов, у которых недавняя крупная амплификация в области 50 т.п.н. T. castaneum хромосомы 8 привела к образованию кластера из 16 близкородственных серпинов (Zou et al. 2007), для которых мы не обнаружили ортологов T. molitor (таблица S7).Еще 40 предполагаемых генов иммунной системы были идентифицированы с помощью терминов BLAST, HMMER и/или GO иммунного ответа (таблица S6). Таким образом, мы идентифицировали членов, принадлежащих к нескольким функциональным классам, недостаточно представленным в T. castaneum , таким как хитотриозидазы и семейство рецепторов-мусорщиков крокемора, а также лизоцимы i-типа, которые не аннотированы в T. кастанеум Различия в содержании генов между Tribolium и Tenebrio также были очевидны в семействах генов AMP, что ожидалось, учитывая, что AMP подвержены быстрой диверсификации с частым дублированием и оборотом (Yang et al. 2011). Расширение и дивергенция очевидны в семействах T. molitor колеоптерицина и аттацина AMP, причем оба имеют больше членов, чем у большинства других жесткокрылых, за возможным исключением божьей коровки Harmonia axyridis (Vilcinskas et al. 2013) . В дополнение к ранее описанному тенецину 4 (Chae et al. 2011) и аттацину C (Dobson et al. 2012) были идентифицированы два аттацина, которые принадлежат к расходящимся филогенетическим группам (рисунок S1) вместе с их соответствующими T .кастанеум ортологи. Напротив, колеоптерицины сформировали видоспецифичные группы (рис. S2) с двумя новыми колеоптерцинами T. molitor , сгруппированными с ранее идентифицированным тенецином 2. Был идентифицирован один новый цекропин, четвертый член этого семейства, о котором сообщалось у жесткокрылых. , подтверждая мнение о том, что цекропины могут быть широко распространены в этом порядке (Zou et al. 2007). Как и в T. castaneum , цекропин обладает атипичным богатым тирозином С-концевым удлинением (данные не показаны).Поразительно, но мы смогли надежно аннотировать только один дефенсин, ранее идентифицированный тенецин 1 (Moon et al. 1994), который принадлежит к специфичной для жесткокрылых кладе дефензинов (Zou et al. 2007). Это контрастирует с T. castaneum , который обладает четырьмя дефенсинами, один из которых принадлежит к кладе примитивных дефенсинов, встречающихся у различных членистоногих (Zou et al. 2007). Два предполагаемых дефенсина были отброшены из-за низкого охвата (таблица S8), но они могут представлять собой транскрипты реальных генов с небольшой экспрессией или без экспрессии в наших тканях-мишенях.Дупликация дефенсина очевидна у многих видов насекомых, включая ос (Gao and Zhu 2010), термитов (Bulmer and Crozier 2004), муравьев (Zhang and Zhu 2012) и комаров (Dassanayake et al. 2007), и мы не можем исключить возможность того, что транскрипты из недавно дуплицированных локусов могут быть разрушены во время сборки, что приводит к недооценке количества копий на протяжении всей сборки.

Экспрессия генов

Временная реакция на иммунную стимуляцию убитыми нагреванием S.aureus был количественно определен путем сопоставления примерно 8 миллионов считываний Illumina размером 100 п.н. на момент времени репликации с эталонной сборкой с последующим попарным сравнением моментов времени с использованием DESeq (Anders and Huber 2010). DESeq идентифицировал 1050 компонентов (из 44 516) как дифференциально выраженные (DE) с течением времени (таблица S9) с минимальным четырехкратным изменением экспрессии при p <0,05 после коррекции FDR. Предшествующая байесовская кластеризация с процессом Дирихле использовалась для кластеризации генов DE по их временной экспрессии и для оценки количества кластеров в данных в соответствии с процедурами Housden et al. (2013 г.) и Fu и др. (2013). В результате было получено 27 кластеров генов DE, отражающих временную экспрессию, величину изменений и дисперсию (рис. S3, таблица S10 и таблица S18). С течением времени дифференциально экспрессируемые иммунные эффекторные гены принадлежали к шести кластерам, демонстрирующим три общих паттерна: временная индукция сразу после иммунного заражения; длительная индукция; или длительное подавление (рис. 2А).

Рисунок 2

Контрастные профили дифференциальной экспрессии генов после иммунного заражения.(A) Шесть кластеров дифференциально экспрессируемых генов, демонстрирующих три временных профиля: транзиторная индукция; длительная индукция; или длительные репрессии. Вертикальные оси представляют центрированный по медиане признак log2 в килобазах на миллион картированных прочтений (FPKM), тогда как горизонтальные оси представляют дни после иммунного заражения. Цветные линии изображают срединный профиль для каждого кластера. (B) Значительно перепредставленная онтология генов в каждом временном профиле. * р < 0,05; ** р < 0.01; *** р < 0,001.

Рисунок 2

Контрастные профили дифференциальной экспрессии генов после иммунного заражения. (A) Шесть кластеров дифференциально экспрессируемых генов, демонстрирующих три временных профиля: транзиторная индукция; длительная индукция; или длительные репрессии. Вертикальные оси представляют центрированный по медиане признак log2 в килобазах на миллион картированных прочтений (FPKM), тогда как горизонтальные оси представляют дни после иммунного заражения. Цветные линии изображают срединный профиль для каждого кластера.(B) Значительно перепредставленная онтология генов в каждом временном профиле. * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.

Транзиторный ответ на иммунную нагрузку

Временный ответ сразу после иммунного заражения включал индукцию распознавания микробов, передачу сигнала и экспрессию иммунного эффекторного гена. Сюда входят гены, кодирующие ранее описанный белок распознавания бета-1,3-глюкана (GNBP3) (Zhang et al. 2003), а также фактор транскрипции NF-kappaB Relish, конечная цель сигнального пути IMD, который сам отвечает за транскрипционную активацию многочисленных иммунных генов (Kounatidis and Ligoxygakis 2012). Ген, кодирующий фенолоксидазу, ключевой фермент в реакции меланизации, который продуцирует цитотоксический меланин, а также окислительные промежуточные продукты с антибактериальной активностью широкого спектра действия (Zhao et al. 2007), также активировался. Повышенная экспрессия генов, кодирующих пероксидазу гема, которая участвует в альтернативном пути меланогенеза (Nappi and Christensen 2005), и аполипофоринов, которые облегчают распознавание бета-1,3-глюкана и фагоцитоз (Whitten et al. 2004 г.; Ханада и др. 2011), предоставляют дополнительные доказательства временного клеточного ответа. Индукция ФАД-глюкозодегидрогеназы, которая усиливает реакцию инкапсуляции за счет образования анионов супероксида (Cox-Foster and Stehr, 1994), и экспрессия гена двойной оксидазы (duox) предполагают роль реактивного кислород-опосредованного уничтожения в ранней фазе иммунного ответа. . Недавняя работа демонстрирует роль дуокса в активации транскрипционного ответа на ранение у Drosophila в дополнение к его роли в качестве иммунного эффектора (Juarez et al. 2011). Мы также обнаружили дополнительные транскрипционные доказательства временного ответа на заживление ран, включая повышенную экспрессию генов, кодирующих спектрин (парша) и интегрин (карст), которые необходимы для закрытия кисетных ран у Drosophila (Campos et al. 2010). ), а также когезин (фасцин) и миосфероид, опосредующие ране-миграционную реакцию плазматоцитов (Comber et al. 2013; Zanet et al. 2009). Гены, кодирующие рецептор эпидермального фактора роста и акулу, которые являются компонентами сигнального пути закрытия раны (Geiger et al. 2011), а также гомолог djub, который позитивно регулирует пролиферацию эпителия через путь гиппопотама у Drosophila (Das Thakur et al. 2010), также активировались. Подтверждая наш вывод об активизации генов, участвующих в иммунитете и закрытии ран, биологический процесс GO называет «иммунным ответом слизистой оболочки» (GO:0002385; p = 0,003), «иммунным ответом в органе или ткани» (GO:0002251; ). p = 0,003), «процесс иммунной системы» (GO:0002376; p = 0.0098), «дорсальное закрытие» (GO:0007394; p = 0,0028) и «морфогенез эпителиального пласта» (GO:0002011; p = 0,0025) были чрезмерно представлены во временно индуцированных кластерах генов (рис. 2В, Таблица S11 и Таблица S12).

Продолжительный ответ на иммунный вызов

Многочисленные термины GO, связанные с иммунными биологическими процессами, были чрезмерно представлены в кластерах длительных ответов, включая «иммунный ответ» (GO: 0006955; p = 6.151663e-04) и несколько дочерних терминов, а также «Toll signaling path» (GO:0008063; p = 0,001) и термины GO «молекулярная функция» «активность ингибитора эндопептидазы серинового типа» (GO:0004867; p ). = 1,621524e-08) и «активность эндопептидазы серинового типа» (GO:0004252; p = 1,582472e-04) (рис. 2B, таблица S13 и таблица S14). Была очевидна длительная индукция генов, кодирующих компоненты сигнального пути Toll, включая ранее описанный грамотрицательный связывающий белок 1 (GNBP1), который инициирует каскад протеолитической активации, который сходится на лиганде Toll Spaetzle (Kounatidis and Ligoxygakis 2012) (рис. 1). ), и ортолог Tribolium бета-1,3-глюкан-связывающего белка 2.Активированы шесть генов сериновых протеаз, в том числе фермент Шпецле-процессинга (SPE) и SPE-активирующий фермент (ортологи дрозофилы easter и змеи соответственно), которые отвечают за заключительные этапы активации Toll, а также семь сериновых протеаз. гены ингибиторов протеаз. Как и в случае Drosophila (De Gregorio et al. 2001), экспрессия самого Toll также индуцировалась после иммунного заражения. Поразительно, но единственными иммунными эффекторными генами, демонстрирующими длительную индукцию, были те, которые кодируют антибактериальные пептиды и железо-секвестрирующий белок ферритин.В отличие от заметной индукции экспрессии генов антибактериальных пептидов, мы не обнаружили изменений в экспрессии генов, кодирующих тауматины или тенецин 3, которые активны против грибов и дрожжей (Kim et al. 1998; Altincicek et al. 2008). ), или лизоцимы i-типа и с-типа. В общей сложности было активировано восемь генов AMP, в том числе четыре аттацина (два из которых были описаны ранее) (Dobson et al. 2012; Chae et al. 2011), три колеоптерицина, включая тенецин 2 (Roh et al. 2009) и дефенсин тенецин 1 (Moon et al. 1994). Чтобы проверить этот результат, кратность индукции экспрессии генов по сравнению с процедурным контролем была определена с помощью относительной количественной ПЦР для подмножества генов AMP с течением времени (рис. 3).

Рисунок 3

Количественная оценка экспрессии гена противомикробного пептида с помощью относительной количественной ПЦР. Столбики погрешностей показывают стандартное отклонение в трех биологических повторностях пулов из 8–10 отдельных насекомых.

Рисунок 3

Количественная оценка экспрессии гена противомикробного пептида с помощью относительной количественной ПЦР.Столбики погрешностей показывают стандартное отклонение в трех биологических повторностях пулов из 8–10 отдельных насекомых.

Аттацин тенецин 4 и колеоптерицин тенецин 2 практически не проявляют антибактериальной активности в отношении S. aureus и других грамположительных бактерий in vitro (Roh et al. 2009; Chae et al. 2010106) . Кроме того, учитывая, что аттацины убивают грамотрицательные бактерии посредством нелитического механизма, который включает связывание липополисахаридов и ингибирование синтеза белков наружной мембраны (Carlsson et al. 1998), вполне вероятно, что аттацин С и два предполагаемых аттацина, идентифицированных здесь, также обладают незначительной активностью в отношении S. aureus . Длительная индукция почти всех антибактериальных пептидов, независимо от их спектра активности, поразительна и может быть результатом недостаточной специфичности иммунного ответа. Альтернативно, антибактериальные пептиды могут взаимодействовать при экспрессии в комбинации или могут действовать сублетальным бактериостатическим образом.

Метаболическая репрессия

Одиночный иммунный ген, кодирующий член рецептора-мусорщика класса B, был репрессирован после иммунного заражения. Резкое подавление многочисленных метаболических генов ясно свидетельствует об общей метаболической репрессии. Из 81 чрезмерно представленного термина GO биологических процессов 55 описывали гены с функциями метаболизма или биосинтеза, включая метаболизм глюкозы, а также биосинтез липидов и витаминов (рис. 2B, таблица S15 и таблица S16). Экспрессия запасного белка гемолимфы гексамерина, который образует резервуар питательных веществ у многих насекомых, также была подавлена. Репрессия необязательных метаболических путей как стоимость интенсивной экспрессии иммунных генов была предложена после полногеномного анализа иммунного ответа у Drosophila (De Gregorio et al. 2001). Недавняя работа продемонстрировала, что активация пути Toll (но не IMD) у Drosophila подавляет передачу сигналов инсулина в жировом теле и, таким образом, уменьшает накопление питательных веществ (DiAngelo et al. 2009). Наши результаты показывают, что компромисс между метаболизмом и иммунитетом может быть общим явлением.

Выводы

Наши данные показывают, что независимая от генома комплексная аннотация РНКсек большей части консервативной иммунной системы насекомых у T.molitor можно. В соответствии с предположениями о четком двухэтапном процессе иммунитета насекомых, как было предложено ранее (Haine et al. 2008a; Schneider and Chambers 2008), мы обнаружили отчетливые временные профили с четкими группами иммунореактивных генов. Примечательно, что гены антимикробных пептидов явно постоянно активировались, тогда как гены, участвующие в конститутивных защитных реакциях, демонстрировали только временную активацию, предположительно частично для пополнения запасов зимогенов, таких как профенолоксидаза.Это согласуется с идеей о том, что антимикробные пептиды активируются в течение длительного времени, чтобы «зачистить» и контролировать персистирующие инфекции (Haine et al. 2008a). Наконец, мы показали подавление метаболических генов, согласующееся с предполагаемой физиологической стоимостью иммунной защиты (Schmid-Hempel 2011), которая часто проявлялась на физиологическом уровне (Adamo et al. 2008; Freitak et al. 2003), но мало изучены на молекулярном уровне.

Благодарности

Мы благодарим К. Титуса Брауна за предоставление бесплатного доступа к коду цифровой нормализации кхмерского языка по лицензии Berkeley Software Distribution. Мы также благодарим Брайана Хааса, Джошуа Орвиса и остальных участников Trinity за оперативную разработку и поддержку программного обеспечения. Мы благодарны Джеку Веррену за помощь в определении предполагаемого ортолога купольного лиганда непарного , Одри Фу за устранение неполадок байесовского пакета кластеризации DIRECT и Яннику Поше за советы по методологии.Исследование было поддержано грантом Европейского исследовательского совета 260986 (Дж.Р.).

Цитированная литература

Adamo

S A

, J. L. Roberts, R. H. Easy, and N. W. Ross,
2008

Конкуренция между иммунной функцией и транспортом липидов за белок аполипофорин III приводит к стресс-индуцированной иммуносупрессии у сверчков.
Дж. Эксп. биол.
211
:
531
–
538
.
ALTINCICEK
B
,
B
,
Knorr
E
,
Vilcinskas
A
,
A
,
2008
Beetle Immunity: Идентификация иммунно-индуцируемых генов от модели насекомых Tribolium Castaneum.
Дев. Комп. Иммунол.
32
:
585
–
595
.
Anders
S
,
Huber
W
,
2010

Анализ дифференциальной экспрессии для данных подсчета последовательностей.
Геном Биол.
11
:
R106
.
Azambuja
P
,
P
,
Freitas
C C
,
GARCIA
E S
,
E S
,
1986
Доказательства и частичная характеристика индуцируемого антибактериального фактора в гемолимфе Длицы Rhodnius.
J. Физиология насекомых.
32
:
807
–
812
.
Браун
CT
,
Howe
A
,
A
,
Q
,
Q
,
Pyrkosz
A
,
BROM
T
,
2012
Справочный алгоритм для вычислительной нормализации данные секвенирования дробовика.
arXiv 1203.4802v.
Bult
P
,
Cociancich
S
,
S
,
Ruuland
M
,
Sauber
F
,
Bischoff
R
et al. ,
1992

Новый дефенсин насекомых опосредует индуцибельную антибактериальную активность личинок стрекозы Aeschna cyanea (Paleoptera, Odonata).
Евро. Дж. Биохим.
209: 977–984.
Bulmer
M S
,
Crozier
R H
,
2004

Дублирование и диверсификация выбора противогрибковых пептидов термитов.
Мол. биол. Эвол.
21
:
2256
–
2264
.
Campos
I
, J. A. Geiger, A. C. Santos, V. Carlos, and A. Jacinto,
2010

Генетический скрининг Drosophila melanogaster выявил новый набор генов, необходимых для восстановления эмбрионального эпителия.
Генетика
184
:
129
–
140
.
Carlsson, A., T. Nyström, H. de Cock, and H. Bennich,
1998
Аттацин – иммунный белок насекомых – связывает LPS и запускает специфическое ингибирование синтеза бактериального белка внешней мембраны.Микробиология 144 (часть 8): 2179–2188.
CHAE
J H
,
J H
,
KUROKAWA
K
,
SO
Y-I I
,
Hwang
H O
,
KIM
M-S
et al. ,
2011

Очистка и характеристика тенецина 4, нового пептида против грамотрицательных бактерий, полученного из жука Tenebrio molitor.
Дев. Комп. Иммунол.
36
:
540
–
546
.
Cherry
S
,
Silverman
N
,
2006

Взаимодействие хозяин-патоген у дрозофилы: новые приемы от старого друга.
Нац. Иммунол.
7
:
911
–
917
.
Кристофиды
G K
,
ZDOBNOV
E
,
BarillaS-Mury
C
,
Birney
E
,
Blandin
S
et al. ,
2002

Гены, связанные с иммунитетом, и семейства генов у Anopheles gambiae.
Наука
298
:
159
–
165
.
COMBER
K
,
K
,
S
,
S
,
Evans
I
,
Sánchez-Sánchez
BJ
,
Chalmers
A
,
Reuter
R
,
Wood
W
,
Martin-Bermudo
M
,
2013

Двойная роль интегринового миосфероида βPS в обеспечении миграции эмбриональных макрофагов дрозофилы.
J. Cell Sci.
126: 3475–3484.
Cox-Foster
D L
,
Stehr
J E
,
1994

Индукция и локализация ФАД-глюкозоагидрогеназы ман-дукабиотических имплантатов (ГЛД) во время инкапсуляции половых имплантатов.
J. Физиология насекомых.
40
:
235
–
249
.
DAS Thakur
M
,
Feng
Y
,
jagannathan
R
,
SEPPA
M J
,
kehunge
J B
et al.,
2010

Белки Ajuba LIM являются негативными регуляторами сигнального пути Hippo.
Курс. биол.
20
:
657
–
662
.
Dassanayake
R S
,
Silva Gunawardene
Y I N
,
,
S S
,
S S
,
S S
,
S S
,
2007
Эволюционные селективные тенденции насекомых / комаров противомикробных пептидов Defensin, содержащие цистеино-стабилизированные альфа / бета-мотивы.
Пептиды
28
:
62
–
75
.
de Gregorio 9001
E
,
E
,
E
,
PT
,
RUBIN
G M
,
LEMAITRE
B
,
2001
,
2001
Геном-анализ иммунного ответа Drosophila с использованием олигонуклеотидных микрочлей.
Проц. Натл. акад. науч. США
98
:
12590
–
12595
.
Diangelo
JR
,
BLAND
мл
,
Bambina
S
,
,
,
,
S
,
Birnbaum
MJ
,
2009
Иммунный ответ ослабляет рост и питательное вещество в Drosophila за счет снижения передачи сигналов инсулина.
Проц. Натл. акад. науч. США
106
:
20853
–
20858
.
Dobson
A J
,
Johnston
P R
,
P R
,
Vilcinskas
A
,
ROLFF
J
,
J
,
2012
Идентификация иммунологической экспрессируемой последовательности Теги в мучше.
J. Физиология насекомых.
58: 1556–1561.
Энаяти, А. и Дж. Хемингуэй,
2010

Борьба с малярией: прошлое, настоящее и будущее.
Энн. Преподобный Энтомол.
55: 569–591.
Falcon
S
,
Gentleman
R
,
2007

Использование GOstats для проверки списков генов на предмет ассоциации терминов GO.
Биоинформатика
23
:
257
–
258
.
FAYE
I
,
PYE
A
,
A
,
Rasmuson
T
,
Boman
H G
,
Boman
I
,
1975
Насекомый иммунитет. 11. Одновременная индукция антибактериальной активности и селективного синтеза некоторых белков гемолимфы у диапаузирующих куколок Hyalophora cecropia и Samia cynthia.
Заразить. Иммун.
12
:
1426
–
1438
.
Finn
RD
,
Clements
J
,
Eddy
S R
,
2011
04 HMER 900 сервер поиска подобия
Рез. нуклеиновых кислот.
39
:
W29
–
W37
.
Freitak
D
,
D
,
I
,
I
,
Vanatea
A
,
Hõrak
P
,
2003
Иммунный ответ энергетически дорого затрат в белых капусте.
Проц. биол. науч.
270
(
Дополнение
):
S220
–
S222
.
FU
A Q
,
Russell
S
,
S
,
BRAY
S J
,
Tavare
S
,
2013
2013
Байесовская кластеризация реплицированных данных экспрессии генов времени со слабыми сигналами.
arXiv 1210.5029v2.
Gao
B
,
Zhu
S
,
2010

Идентификация и характеристика дефенсинов паразитической осы Nasonia, направленная на функциональную область?
Дев. Комп. Иммунол.
34
:
659
–
668
.
Geiger
J A
, L. Carvalho, I. Campos, A.C. Santos, and A. Jacinto,
2011

Мутантные фенотипы Hole-in-one связывают передачу сигналов EGFR/ERK с восстановлением эпителиальной ткани у дрозофилы.
PLoS ONE
6
:
e28349
.
GRABHERR
MG
,
HAAS
BJ
,
Yassour
M
,
LEVIN
JZ
, DA THOMPSON et al .,

et al .,

2011

Полнометражная транскриптовная сборка из РНК Данные Seq без эталонного генома.

Нац. Биотехнолог.

644

–

652

Грэм

Л А

, В.K. Walker, and P.L. Davies,

2000

Развитие и регуляция окружающей среды белков-антифризов у мучного жука Tenebrio molitor.

Евро. Дж. Биохим. 267: 6452–6458.

HAAS

B J

PAPANICAOLOU

Yassour

GRABHERR

кровь

P D

et al. ,

2013

Реконструкция последовательности транскрипта De novo из секвенирования РНК с использованием платформы Trinity для создания эталонов и анализа.

Нац. протокол

1494

–

1512

Haine

E R

MORET

SIVA-JOTHY

M T

ROLFF

2008

Антимикробная защита и постоянная инфекция в насекомых.

Наука

322

1257

–

1259

Haine

POLLITT

MORET

SIVA-JOTHY

ROLFF

2008

Временные узоры в иммунных ответах на ряд микробных поражений (Tenebrio molitor).

J. Физиология насекомых.

1090

–

1097

HANADA

Sekimizu

Kaito

2011

Silkworm ApolipoPhorin Белок ингибирует стафилококку Aureus Virulance.

Журнал биол. хим.

286

39360

–

39369

Housden

B E

A Q

KREJCI

Bernard

Fischer

et al.,

2013

Динамика транскрипции, вызываемая коротким импульсом активации надреза, включает прямую регуляцию с помощью генов E(spl)/Hes.

PLoS Genet.

e1003162

Johnston

Rolf

2013

Иммуно- и ранезависимая дифференциальная экспрессия генов у древнего насекомого. Дев. Комп. Иммунол. 40: 320–324.

Хуарес, М. Т., Р. А. Паттерсон, Э. Сандовал-Гиллен и В. McGinnis, 2011 Duox, Flotillin-2 и Src42A необходимы для активации или ограничения распространения транскрипционного ответа на раны эпидермиса у Drosophila. Генетика PLoS. 7: e1002424.

Kafatos, F., R. Waterhouse, E. Zdobnov, and G. Christophides, 2009 Сравнительная геномика иммунитета насекомых, стр. 86–105 в Insect Infection and Immunity , под редакцией J. Rolff и S. E. Reynolds. Издательство Оксфордского университета, Оксфорд, Великобритания.

KIM

Lee

Y T

Lee

Y J

Chung

J H

Lee

B LE

et al.,

1998

Бактериальная экспрессия тенецина 3, противогрибкового белка насекомых, выделенного из Tenebrio molitor, и его эффективная очистка.

Мол. Ячейки

786

–

789

Korner

Schmid-Hempel

2004

In vivo динамика иммунного ответа у шмелей Bombus terrestris.

J. Invertebr. Патол.

–

Kounatidis

Ligoxygakis

2012

Дрозофила как модельная система для раскрытия слоев врожденного иммунитета к инфекциям.

Открытый биол.

2: 120075.

Krogh

BARSSON

VON HEIJNE

Sonnhammer

2001

Прогнозируя топология трансмембранного белка с скрытой моделью Markov: приложение для полных геномов.

Дж. Мол. биол.

305

567

–

580

Kurokawa5

Gong

J-H

RYU

K-H

Zheng

CHAE

J-H

et al. ,

2011

Биохимическая характеристика уклонения от распознавания пептидогликана Staphylococcus aureus D-аланилированная стеночная тейхоевая кислота при врожденном иммунитете насекомых.

Дев.Комп. Иммунол.

835

–

839

Langmead

Trapnell

Salzberg

S L

2009

Ультрализация и эффективное выравнивание памяти коротких последовательностей ДНК к человеческому геному.

Геном Биол.

R25

Lemaitre

Николя

Michaut

Reichhart

и JM

A. Hoffmann,

1996

Дорсовентральная регуляторная генная кассета spätzle/Toll/cactus контролирует мощную противогрибковую реакцию у взрослых дрозофил.

Сотовый

973

–

983

Dewey

2011

RSEM: точная количественная оценка транскриптов по данным RNA-Seq с эталонным геномом или без него.

Биоинформатика BMC

323

вход

F H

Balmand

Vallier

Vincent-Monegat

Vigneron

et al. ,

2011

Антимикробные пептиды контролируют эндосимбионты насекомых.

Наука

334

362

–

365

Мишель

Kafatos

F C

2005

Иммунитет комаров против Plasmodium.

Биохимия насекомых. Мол. биол.

677

–

689

Moon

Lee

Kurata

Natori

Lee

1994

Очистка и молекулярное клонирование кДНК для индуцируемого антибактериальный белок личинок жесткокрылых Tenebrio molitor.

J. Biochem.

116

–

Nappi, A.J., and B.M. Christensen,

2005

Меланогенез и связанные с ним цитотоксические реакции: приложения к врожденному иммунитету насекомых.

Биохимия насекомых. Мол. биол. 35: 443–459.

Обряд

D J

WELCH

J j

KIM

K-W

Jiggins

F M

2009

Количественная количественная адаптивная эволюция в иммунной системе Drosophila.

PLoS Genet.

e1000698

Park

J W

KIM

C H

RUI

Park

K H

RYU

K H

et al. ,

2011

Beetle Immunity

, с.

163

—

180

—

180

Imbunity

, отредактирован K.

Söderhäll

Springer Science + Business Media LLC, BioScience Landes, N. y, USA

PETERSEN

T N

BRUNAK

VON HEIJNE

Nielsen

2011

SignalP 4.0: различение сигнальных пептидов из трансмембранных областей.

Нац. Методы

785

–

786

ROH

K-B

KIM

C-H

Lee

Kwon

H-M

Park

J-W

et al. ,

2009

Протеолитический каскад для активации пути уничтожения насекомых, индуцированного компонентом клеточной стенки грибов.

Дж.биол. хим.

284

19474

–

19481

Рольф, Дж. и С. Рейнольдс, 2009 Инфекция насекомых и иммунитет , Издательство Оксфордского университета, Оксфорд, Великобритания.

Ross

Jiang

Kanost

Wang

2003

Сериновые протеазы и их гомологи в Drosophila Melanogaster Genome: первоначальный анализ сохранение последовательности и филогенетические отношения.

Гена

304

117

–

131

Schmid-Hempel

2011

Эволюционная паразитология

Oxford University Press, Oxford

Schneider

D S

Чемберс

2008

Иммунитет к мошенническим насекомым.

Наука

322

1199

–

1200

Schwarz

R S

Evans

J D

2013

Одно- и смешанные трипаносомы и микроспоридии вызывают отчетливую и эфемерную клеточную реакцию у пчел.

Дев. Комп. Иммунол.

300

–

310

Soneson

Delorenzi

2013

Сравнение методов дифференциального анализа экспрессии данных секвенирования РНК.

Биоинформатика BMC

Vilcinskas

MUKHERJEE

Vogel

2013

Расширение антимикробного пептида репертуара в инвазивной божьей Божьего Hampionia Axyridis.

Проц. биол. науч.

280

20122113

Waterhouse

ZDOBNOV

Tegenfeldt

Kriventseva

2011

Orthodb: иерархический каталог эукариотических ортологов в 2011.

Nucleic Acids Res.

D283

–

D288

Уиттен

М М А

, И.Ф. Тью, Б. Л. Ли и Н. А. Рэтклифф, 2004 г. Новая роль аполипопротеина насекомого (аполипофорин III) в распознавании паттерна бета-1,3-глюкана и реакциях клеточной инкапсуляции. Дж. Иммунол. 172: 2177–2185.

Yang

CHENG

DENG

et al. ,

2011

Функциональное расхождение среди антимикробных пептидных паралогов тутового шелкопряда по активности рекомбинантных белков и профилям индуцированной экспрессии.

PLoS ONE

e18109

Zanet

Remamer

Millard

Martin

Payre

et al.

2009

Фасцин необходим для миграции клеток крови во время эмбриогенеза дрозофилы.

Разработка

136

2557

–

2565

Чжан

чо

H Y

KIM

H S

мА

Y G

Osaki

et al.,

2003

Характеристика и свойства белка распознавания образов 1,3-бета-D-глюкана личинок Tenebrio molitor, который специфически расщепляется сериновой протеазой во время активации профенолоксидазы.

Журнал биол. хим.

278

42072

–

42079

Zhang

Zhu

2012

Сравнительный геномный анализ пяти семейств антимикробных пептидоподобных генов у семи видов муравьев.

Дев. Комп. Иммунол.

262

–

274

Zhao

Wang

Jiang

2007 H

2007

Широкий спектр антимикробная активность реакционноспособных соединений, создаваемых in vitro путем фенолоксидазы Manduca Sexta .

Биохимия насекомых. Мол. биол.

952

–

959

Zou

Evans

J D

Zhao

Williams

et al.,

2007

Сравнительный геномный анализ иммунной системы Tribolium.

Геном Биол.

R177

Примечания автора

Комиксы 🙂

Сомнительное содержание
Джеф Жак CA
5/7

Стоять на месте Молчать
Минна Сандберг FI
LMaJV

Космический траулер
Кристофер Болдуин США
LMMJ

Кидд Командир!
Ария Белл US
LMV

Gunnerkrigg Court
Tom Siddell UK
LMV

Ваши фотографии
Gibson Twist
LMV

Wilde Life
Паскаль Лепас US
LMV

Звездное путешествие
Жизель Джобате CA
LMV

xkcd
Рэндалл Манро
LMV

Божья рабыня
Миган Картер CA
LJ

Перитале
Мари Коста PT
LJ

Дары блуждающего льда
Макарова Ольга RU
LV

Неудовлетворенный
Taylor Robin US
LV

Castoff
Star US
LV

Снег ночью
Эрик Менге США
MaJ

Лунный бабуин

МаВ

Виддершинс
Кейт Эшвин Великобритания
МаВ

Witchy
Ариэль Райс AU
MaV

Gaia
Пури Андини и Оливер Кнорцер, Германия
MaV

Сейчас перезаряжается
Maiji/Mary Huang CA
MaV

Как быть оборотнем
Шон Ленор США
MeJ

Год в будущем
Микаэль Х. FI
МэВ

933 доллара
Tom Johns & Dana Köpke DE
MeS

Сердце Кеола
Мин «Кейиии» Квон США
Мед.

Забытый заказ
Christy Bontrager US
L

Носки с пятнами крови
Tober AU
L

O Human Star
Blue Delliquanti US
L

Пропавший понедельник
Эль Скиннер США
млн лет

Конец
Ран и Кори Браун CA
Ма

Другой известный
Лора Мерриман
Я

Суихира: город воды
Риана Дорси США
Я

Шамси
Тристан Дж.Таруотер и Адриан Рикер
J

Серебряный глаз
Лора Холлингсворт США
V

Яркая сторона
Эмбер Фрэнсис AU
S

Sprinter
Marowe & Isto US
S

Бродсайд
Ноэлла Уитни США
D

Следующий город за
Эрин Мехлос США
D

Brainchild
Сюзанна Гири
D

Банки с фасолью
Тамара
1/7

Лунный бабуин

Блайндспрингс
Кади Федорук CA
MaJS

Галантус
Ашанти Фортсон США

Everblue
Майкл Секстон США

164 дня
Кирсти Мордаунт Великобритания
L

Сильвания
Кристин Кемпер США

Марго Малу
Дрю Вейинг США
MaJ

Eths-кожа
Sfe R. монстр
я

Судный день, моя дорогая
Ками Вудрафф US
S 2juin

Avalia
Delaney Januzzi AU
Ma fin mai

Надпись на стене
Изаак Пулхэм
S

Что нужно
KEZ US

Один
Оливия Стивенс США

Монстр под кроватью
Брэндон Шейн

Неверный файл
Крис Хейзелтон

Архивы демонов
Даниэль Шарп и Себастьян Пириз США

Дети Элдаира
Рэйчел А.Оукс и Джемма М. Янг США

Наше время в Эдеме
Гибсон Твист и Бен Стивс

Воспроизведение
Неважно PL

Мечтательница
Лора Иннес

Хиатус

Godsblood
Фишер ВК США

Затерянный остров На-Рун-Ток
Джина Трухильо и Соня Гонсалес США

Семьянин
Дилан Меконис США

Эон Вэлли
Майкл Джеймс США

Кукольный домик
Рэй США

Зопилот пернатый
Вирус Visal MX

Оттенки
Алекс Хеберлинг США

Борис и Бьорн
Джаред М Оуэнс

Конец

Широ
Варэтан (Элли Ром Колтофф)

Анна Галактическая
Кристофер Болдуин

Взлет
Миган Картер

Гаранос
Алекс Хеберлинг

Истории Сайджики
Линн и Марк Опаскар

Истории былых времен
Джина Биггс, Луиза Рой и Эль Скиннер

Инверлох
Сара Эллертон

Zap
Паскаль Лепас

Колокол в океане
Анна Сарлинг-Хамм

Мечта краснохвоста
Минна Сандберг

В одну сторону
Кристофер Болдуин

История Ивы
Серый

Физиологические, биохимические и молекулярно-биологические характеристики

Было показано, что организмы с высокоорганизованной центральной нервной системой проявляют более выраженные реакции на экстремальные воздействия, в том числе на гипоксию, по сравнению с организмами с более низким уровнем организации [179,180,181]. Центральная нервная система человека в целом и, в частности, кора головного мозга весьма восприимчивы к дефициту О ₂, в то время как мелкие млекопитающие, такие как грызуны, и, особенно, лабораторные животные, имеют значительно более высокую плотность капилляров в тканях, что способствует их большей устойчивости к гипоксии [11,181]. Кроме того, беспозвоночные, такие как Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , Daphnia magna [182, 183, 184, 185], и некоторые позвоночные — отдельные виды рыб, голый землекоп и др.[186,187,188] — известны как организмы, устойчивые к гипоксии. У многих беспозвоночных и некоторых экзотермных видов позвоночных поддержание гипометаболизма также лежит в основе огромной толерантности к большому разнообразию стрессовых факторов, включая гипоксию, ишемию и гипотермию у мелких млекопитающих, находящихся в спячке [8]. Таким образом, методы определения устойчивости к гипоксии у лабораторных животных, более толерантных, чем человек, включают использование экстремальных высот.

4.1. Методы определения толерантности к гипоксии у животных

Экспериментальные модели высотных заболеваний человека в основном включают использование декомпрессионной камеры [189, 190, 191].Кроме того, среди экспериментальных животных наиболее распространенным методом определения толерантности к недостатку кислорода является модель, воспроизводящая условия гипобарической гипоксии в декомпрессионных камерах путем управляемой откачки воздуха [11,14,18,19,128].

Обычно для экспериментальных животных используют экстремальные высоты, соответствующие нарушениям дыхания и признакам асфиксии. Для беспородных крыс и крыс Вистар используются высоты 11000–11500 м; для крыс Sprague-Dawley 9250–10668 м [9,11,12,14,18,19,126,192,193,194].Был предложен другой метод определения индивидуальной толерантности к гипоксии: ступенчатый «подъем» животных в декомпрессионной камере на платформы, соответствующие разным высотам, до регистрации агонального дыхания [195].

Известен способ определения устойчивости к гипоксии при вдыхании газовой смеси, содержащей 3% кислорода в азоте, во время от начала вдоха до начала апноэ. Вдыхание такой газовой смеси несовместимо с жизнью; однако индивидуальное время выживания крыс значительно различается — у разных животных остановка дыхания наступает в сроки от 1 до 30 мин [196].

В настоящее время альтернативного метода отбора организмов на толерантные и восприимчивые к гипоксии группы в экспериментальных исследованиях не существует, кроме определения времени выживания в условиях острого гипоксического воздействия в декомпрессионной камере или в условиях дыхание газовой смесью.

В результате определения устойчивости к гипоксии животных делят на толерантных, нормальных и восприимчивых. Соотношение может меняться в зависимости от многих факторов (сезона, времени суток и т.). Как показывает практика, значительное соотношение приходится на нормальных животных (40-58%), доля толерантных животных колеблется от 20 до 42%, а восприимчивых — от 18 до 40% [9,11,12,126,194].

Определение толерантности к гипоксии животных, как правило, проводят однократно и эксперимент проводят сразу после воздействия, через час, неделю, две недели, три недели или месяц [9,11,12 ,14,17,20,21,22,126,127,192,197,198,199]. Некоторые авторы проводят тест несколько раз через определенные промежутки времени; например, трижды с недельным интервалом [11,12,14,127].Рекомендуется использовать интервал в один месяц после определения толерантности к гипоксии для устранения эффекта гипоксического воздействия и выявления исходных различий между фенотипами животных [17,18,19,21,22]. Показано, что через месяц после процедуры тестирования у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных сохраняются различия по многим параметрам [17, 18, 19, 21, 22, 200]. Однако без метода определения толерантности к гипоксии, исключающего использование декомпрессионной камеры, невозможно выяснить, являются ли эти различия предсуществующим признаком или результатом гипоксического воздействия.Поэтому целесообразен поиск молекулярно-биологических маркеров, концентрация которых различается у организмов с разной толерантностью к гипоксии в условиях нормоксии или при компенсированном гипоксическом воздействии.

При определении толерантности к гипоксии необходимо учитывать, что она, так же как и толерантность к развитию инфекционно-воспалительных и опухолевых заболеваний, может зависеть от возраста и пола. В ряде экспериментальных работ выявлены половые и возрастные различия в способности адаптироваться к высокогорью [201,202].После гипоксического воздействия у самок дыхание восстанавливается быстрее, чем у самцов [203]. По сравнению с самцами, самки крыс более устойчивы к гипоксии: среди самок преобладают толерантные к гипоксии микроорганизмы, а самцы преимущественно восприимчивы и нормальны. Нами выявлены половые различия в морфофункциональном состоянии иммунной системы в зависимости от толерантности к гипоксии [200,204].

Новорожденные животные выживают при одночасовом воздействии крайне выраженной степени гипоксии (13000 м).Это могло быть связано с физиологической незрелостью нервной и эндокринной систем и связанным с этим низким потреблением кислорода. Мы обнаружили, что по сравнению с новорожденными и взрослыми животными препубертатные крысы линии Вистар обладают наименьшей толерантностью к гипоксии, что коррелирует с наиболее выраженными проявлениями системной воспалительной реакции [204].

Другие факторы также могут влиять на точность измерения толерантности к гипоксии. Биологические ритмы являются важными, но до конца не изученными факторами, влияющими на толерантность к гипоксии.По данным литературы установлен суточный ритм чувствительности животных к недостатку О ₂: в вечернее и ночное время время выживания в условиях гипобарической гипоксии меньше, чем в дневное время. Известно также, что существуют сезонные колебания толерантности к гипоксии. Минимум восприимчивых организмов отмечен в осенне-зимний период, максимум – в летний. Соотношение толерантных к гипоксии животных было максимальным с ноября по январь и минимальным в мае-июне [205,206].Помимо суточных и сезонных биоритмов были продемонстрированы инфрадианные биоритмы гормонов и других процессов [207]. Нами был установлен 4-суточный инфрадианный биоритм толерантности к гипоксии у крыс Wistar и Sprague-Dawley, который находился в фазе с биоритмом кортикостерона [193]. В акрофазе инфрадианного 4-дневного биоритма кортикостерона время выживания животных на высоте было выше, чем в его батифазе, что было продемонстрировано как у крыс Wistar, так и у крыс Sprague-Dawley, различающихся по толерантности к гипоксии. При исследовании чувствительности к определению дефицита О ₂ необходимо учитывать наличие 4-х дневных колебаний этого параметра [193].

Таким образом, основным методом определения толерантности к гипоксии у экспериментальных животных является использование декомпрессионной камеры. Тем не менее используемые подходы значительно различаются в зависимости от дизайна исследования и часто не учитывают влияние различных факторов. В дальнейшем необходимо стандартизировать метод определения толерантности к гипоксии на экспериментальных моделях животных.

4.2. Молекулярно-биологические, патофизиологические и биохимические различия толерантных и восприимчивых к гипоксии животных

Исследования с использованием декомпрессионной камеры позволили выявить различия по некоторым параметрам у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных; однако из-за разнообразия методов данные трудно сравнивать. Было обнаружено, что толерантные и восприимчивые к гипоксии животные различаются по экспрессии HIF-1 через месяц после определения толерантности к дефициту кислорода [13,18]. Обнаружена обратная связь между основным содержанием HIF-1 в неокортексе и устойчивостью беспородных крыс-самцов к гипоксии: у восприимчивых организмов в условиях нормоксии уровень HIF-1 был в 1,7 раза выше, чем у толерантных крыс [13]. Таким образом, было обнаружено, что толерантные и восприимчивые к гипоксии животные различаются по многим параметрам, в том числе по экспрессии HIF-1. Следовательно, нормоксический уровень HIF-1 может быть репрезентативным и важным маркером для определения восприимчивости к гипоксии. Эти результаты согласуются с исследованиями на людях.Как уже упоминалось выше, у восприимчивых к ВОЛ людей наблюдается более высокий уровень HIF-1α в сыворотке крови при нормоксии [100]. HIF-1 считается биомаркером успешной адаптации к различным формам гипоксии [35, 208, 209, 210], и, кроме того, HIF-1 может быть использован в качестве селекционного диагностического маркера для лиц, вынужденных работать в условиях экстремальной гипоксии [211]. Этот вопрос требует дальнейшего внимания. Более того, несмотря на выявленные различия в экспрессии HIF-1 у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных, исследования других изоформ HIF (HIF-2 и HIF-3) в этом контексте пока не проводились.Учитывая роль HIF в адаптации к гипоксии и развитии заболеваний, различия в уровне экспрессии основного HIF и его изоформ могут определять предрасположенность к развитию некоторых инфекционных, воспалительных и опухолевых заболеваний наряду с уже известным возрастом, полом, и другие факторы.

Хорошо изучены структурные различия митохондрий, которые играют ключевую роль в восприятии кислорода и образовании свободных радикалов у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных, изученных через месяц после пребывания на экстремальных смоделированных высотах [17,21]. ].Авторами показано, что митохондрии клеток коры головного мозга, печени и сердца толерантных и восприимчивых к гипоксии крыс различаются как по структурным, так и по основным функциональным параметрам. В условиях нормоксии через месяц после определения толерантности к гипоксии клетки коры головного мозга толерантных крыс характеризовались повышенным содержанием митохондрий с более плотно упакованными кристами и темным матриксом, большим количеством мелких митохондрий и более высокой концентрацией митохондриальной ферменты, такие как субъединица A сукцинатдегидрогеназы (SDHA), цитохром b (Cyt b), субъединица I цитохром C-оксидазы (COX1) и сукцинат против митохондрий у восприимчивых крыс. Напротив, количество митохондриальных крист в митохондриях мозга восприимчивых к гипоксии крыс было меньше, чем в митохондриях толерантных крыс. Более мелкие митохондрии с более плотной упаковкой крист функционально более активны [15, 212, 213], что согласуется с более высокой базовой функциональной активностью митохондриального энергетического аппарата коры головного мозга у толерантных к гипоксии крыс по сравнению с восприимчивыми крысами.

Большое количество мелких митохондрий в коре головного мозга у толерантных к гипоксии крыс является показателем повышенной метаболической активности митохондрий и более высокой интенсивности окислительного фосфорилирования у этих крыс по сравнению с восприимчивыми крысами.Это согласуется с результатами более ранних исследований, показавших различную интенсивность окислительного фосфорилирования в коре головного мозга у крыс с толерантной и восприимчивой устойчивостью к гипоксии [214, 215]. Таким образом, в условиях нормоксии наблюдаются фенотипические ультраструктурные, функциональные и метаболические различия между митохондриями клеток коры головного мозга толерантных и восприимчивых к гипоксии крыс. Они указывают на большую активность дыхательной цепи у толерантных к гипоксии крыс по сравнению с восприимчивыми крысами.Эти различия также свидетельствуют о том, что энергетический обмен является определяющим фактором индивидуальной толерантности к гипоксии.

Также было отмечено, что в митохондриях клеток печени толерантных к гипоксии животных скорость АТФ-зависимого транспорта К+, отражающая активность митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, была выше. В то же время количество К+ в митохондриях печени и сердца было выше у восприимчивых к гипоксии крыс [9].

В работе [22] показано, что через месяц после определения толерантности к гипоксии скорость захвата Ca ²⁺ митохондриями клеток печени и сердца у толерантных к гипоксии крыс была выше, чем у восприимчивых крыс, что связано с различиями в уровне некоторых канальных субъединиц в митохондриях.Способность удерживать кальций в митохондриях клеток печени у толерантных к гипоксии крыс была в 1,3 раза выше, чем у восприимчивых. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в митохондриях клеток печени и сердца у толерантных к гипоксии животных проявляются функционально-структурные особенности в транспорте ионов Ca ²⁺ , что может иметь значение для функционирования митохондрий в условиях гипоксии, а также способствуют формированию адаптивных признаков, обеспечивающих развитие клеточного ответа на дефицит кислорода.Эти изменения могут лежать в основе чувствительности клеток к гипоксическому повреждению на молекулярном уровне.

Предложена концепция существования разных эволюционно сложившихся «функционально-метаболических паттернов», соответствующих двум типам животных с разной устойчивостью к острой кислородной недостаточности [9,15,21,216]. В основе этих закономерностей лежат особенности энергетического аппарата, состояния центральной нервной системы и нейрогуморальной регуляции, определяющие реакцию организма на гипоксию.Толерантные к гипоксии животные представляют собой тип организмов, отличающихся от восприимчивых максимально активированными защитными, антигипоксическими механизмами, что делает их чрезвычайно устойчивыми к кратковременным острым гипоксическим воздействиям. Специфическая ультраструктура митохондрий толерантных и восприимчивых крыс, продемонстрированная в [9,17,21,22], также подтверждает представление о том, что животные с разной толерантностью к гипоксии имеют два различных функционально-метаболических профиля. Они связаны с различиями функциональной активности энергетической системы, состояния мембран и рецепторного аппарата.

Животные, относящиеся к двум противоположным типам толерантности к гипоксии, имеют существенные различия в эффективности энергетического обеспечения организма, регуляции центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, нейрогуморальной регуляции, стрессактивирующей и стресслимитирующей системах, кислородтранспортной функции кровь и состояние мембран и рецепторов [10,15,217].

Симпатическая регуляция преобладает у восприимчивых крыс, в то время как парасимпатическая регуляция преобладает у толерантных животных [218].Считается, что восприимчивые к гипоксии животные имеют слабый тип нервной системы, менее развитое внутреннее торможение, повышенную возбудимость и эмоциональную реактивность. На гипоксию они реагируют возбуждением и высокой двигательной активностью. Восприимчивые к гипоксии животные более склонны к развитию таких заболеваний, как сахарный диабет, ожирение, тиреотоксикоз, атеросклероз и др. [15,217]. Такие данные согласуются с приведенной выше информацией о человеке: косвенным маркером предрасположенности к развитию ОГБ может быть повышенная тревожность на уровне моря [152].Напротив, у толерантных к гипоксии животных снижены возбудимость и тревожность, проявляются умеренная агрессивность, более выраженная внутренняя заторможенность, низкая чувствительность к любым провоцирующим факторам и тенденция к социальному доминированию, они более устойчивы к анестезии. На острую гипоксию, ишемию головного мозга и отравление угарным газом они реагируют тормозной реакцией [15, 217].

Показано, что физическая выносливость организма у толерантных к гипоксии крыс значительно выше, чем у восприимчивых, что указывает на ее прямую связь с толерантностью к дефициту кислорода. Было замечено, что продолжительность жизни толерантных к гипоксии крыс была на 15% выше, чем у восприимчивых крыс [219].

У толерантных и восприимчивых к экстремальной гипобарической гипоксии крыс обнаружены некоторые различия в исходном распределении сердечного выброса: толерантные животные отличались меньшим кровотоком в скелетных мышцах и имели более высокий кровоток в головном мозге, сердце, почках , и легкие. Эти особенности наиболее выражены между толерантными и восприимчивыми крысами при стрессовых реакциях. При определении толерантности путем воздействия острой тяжелой гипоксии (3% О ₂ ) у белых беспородных крыс-самцов, как толерантных, так и восприимчивых, отмечалось снижение АД; однако степень снижения была неодинаковой — у толерантных животных при исходном среднем АД 110–120 мм рт. ст. наблюдалось снижение до 50–60 мм рт. ст.; у восприимчивых — до 30 мм рт.ст. и ниже.Снижение артериального давления у крыс при гипоксии объясняется расширением сосудов в большинстве органов и тканей, в том числе в почках, скелетных мышцах и головном мозге. Также отмечается снижение частоты сердечных сокращений: у толерантных животных на 10–20 уд/мин, у восприимчивых животных более чем на 40–50 уд/мин. Следовательно, толерантные к дефициту кислорода животные характеризуются благоприятным кислородным режимом и имеют предпосылки для более длительного выживания в условиях тяжелой острой гипоксии по сравнению с восприимчивыми животными [196].

Также проводятся исследования различных параметров толерантных и восприимчивых к гипоксии животных сразу после пребывания на экстремальной смоделированной высоте; в некоторых случаях испытания в декомпрессионной камере проводят трижды с определенным интервалом. Преимущественно в этих работах изучаются уровни активности различных ферментов, а также содержание гормонов в крови, поскольку гипоксическое воздействие вызывает стресс и способствует изменению концентрации катехоламинов (адреналина и норадреналина) и кортикостерона.Адреналин и норадреналин высвобождаются почти сразу после того, как симпатическая нервная система реагирует на стресс. Исследовали содержание норадреналина сразу после разделения крыс Sprague–Dawley на толерантных и восприимчивых при моделировании гипобарической гипоксии на высоте 10668 м [126]. Оказалось, что уровень норадреналина в плазме крови у толерантных к гипоксии животных был достоверно выше, чем у восприимчивых. Значительное повышение концентрации норадреналина позволяет толерантным крысам эффективнее справляться со стрессом, чем восприимчивым крысам.Масса надпочечников у толерантных к гипоксии крыс была значительно выше, чем у восприимчивых [126].

Выделение пролактина гипофизом считается очень чувствительным маркером стресса у млекопитающих [220]. Помимо участия в репродуктивных процессах, пролактин играет роль в поддержании равновесия внутренней среды, регуляции функционирования иммунной системы, осмотического баланса и ангиогенеза. Адаптация к стрессу связана со снижением реакции пролактина [220, 221].Показано, что у толерантных к гипоксии животных уровень пролактина в плазме значительно ниже, чем у восприимчивых животных [126], что свидетельствует о более эффективной адаптации толерантных крыс к гипоксическому воздействию.

По данным [126], в плазме крови толерантных к гипоксии крыс сразу после однократного измерения толерантности к гипоксии содержание адренокортикотропного гормона (АКТГ) и тестостерона было выше. Известно, что в ранние сроки после стрессорного воздействия повышается концентрация кортикостерона в плазме крови.Данные литературы о содержании кортикостерона у толерантных и восприимчивых к гипоксии крыс противоречивы: по данным [126], достоверных различий в уровне общего кортикостерона в плазме крови у толерантных и восприимчивых к гипоксии крыс не обнаружено. крыс сразу после тестирования. Однако, по данным [14], в плазме крови толерантных и восприимчивых к гипоксии крыс линии Sprague-Dawley сразу после трехкратного гипоксического воздействия на экстремальной высоте содержание кортикостерона было выше, чем у толерантных животных.Такие различия, вероятно, связаны с различиями в методах определения толерантности к гипоксии.

В сердце и плазме крови крыс Sprague–Dawley сразу после трех последовательных измерений толерантности к гипоксии исследовали уровень эритропоэтина и эндотелина-1, играющих важную роль в поддержании целостности сосудов. Эндотелин регулирует тонус сосудов легких при воздействии гипоксического стресса; у восприимчивых к гипоксии животных его экспрессия увеличивается в 30 раз в миокарде, что вызывает его гипертрофию и сердечную дисфункцию [11, 222].В крови его концентрация также была повышена у восприимчивых к гипоксии крыс [14]. Содержание эритропоэтина, стимулирующего эритропоэз, повышалось в сердце и крови у толерантных к гипоксии крыс, а у восприимчивых, наоборот, снижалось [11,14].

В сердце толерантных к гипоксии крыс Sprague-Dawley сразу после трех последовательных измерений толерантности к гипоксии уровень синтеза белка HIF-1α увеличился в два раза, в то время как у восприимчивых крыс это увеличение было не столь значительным [11] .Мы также показали повышение уровня экспрессии HIF-1 у толерантных к гипоксии крыс Вистар после однократного измерения устойчивости к дефициту кислорода, сопровождающееся повышением содержания VEGF и эритропоэтина [194]. Повышение уровня экспрессии HIF-1 после гипоксического воздействия у толерантных животных, по-видимому, способствует их быстрой и более эффективной острой адаптации к дефициту кислорода [208, 210, 223].

Оксид азота (NO) является мощным сосудорасширяющим средством, которое играет противовоспалительную роль, проявляет противомикробное действие, антитромбоцитарную активность, способствует митохондриальному биогенезу (улучшение производства АТФ) и способствует ангиогенезу [224, 225, 226].Уровень NO в миокарде у толерантных к О ₂ дефицитных животных повышается в 2 раза, что повышает способность к поддержанию нормальной дыхательной деятельности в течение длительного времени при острой гипоксии [11,14]. Активность eNOS и iNOS в миокарде была выше у толерантных к гипоксии крыс, чем у восприимчивых [14]. Как упоминалось ранее, у людей, предрасположенных к ВОЛ, также наблюдаются более низкие уровни выдыхаемого NO по сравнению с субъектами, толерантными к ВОЛ, во время острого воздействия гипоксии.Можно предположить, что высокие уровни NO можно использовать в качестве биомаркеров выраженной толерантности к гипоксии после острого гипоксического воздействия.

В плазме толерантных к гипоксии животных также выявлен более высокий уровень NO по сравнению с восприимчивыми крысами [127]. Повышенный уровень АФК и продуктов перекисного окисления липидов снижает доступность NO в кровотоке, что увеличивает риск тромбоза [226]. Следовательно, синтез NO и его доступность влияют на конечный физиологический результат при воздействии гипоксии.В связи с важной ролью NO в регуляции артериального давления, кровотока и других жизненно важных функций организма крайне важно защитить доступный NO от действия АФК при гипоксии. Снижение продукции оксидантов или противодействие им антиоксидантными системами при гипоксии может обеспечить повышение толерантности к гипоксии [227]. Показано, что уровни ферментов, таких как супероксиддисмутаза и каталаза, которые защищают клетки от окислительного стресса, выше в сердце толерантных к гипоксии крыс Sprague-Dawley после трехкратного гипоксического воздействия [11].Таким образом, активность этих ферментов повышена у толерантных животных, что позволяет уменьшить окислительный стресс, вызванный гипоксией. В то же время у восприимчивых к гипоксии животных активность каспазы-3, способствующей апоптозу, выше [12]. Экспрессия наиболее изученных белков теплового шока — HSP27, HSP60, HSP70 и HSP90 — в миокарде толерантных к гипоксии крыс была значительно повышена, что свидетельствует об их способности преодолевать длительное воздействие дефицита О ₂ и более эффективная адаптация [11,14].Различия в уровне БТШ70 обнаружены не только у крыс с разной толерантностью к гипоксии, но и у людей с разной толерантностью к АМС, о чем уже говорилось выше. Таким образом, HSP70 может быть потенциальным биомаркером высокой толерантности к гипоксии.

Кроме того, были проведены исследования маркеров оксидативного стресса, и оказалось, что уровень малонового диальдегида, образующегося при воздействии гипоксии, почти в восемь раз выше в сердце восприимчивых к дефициту кислорода крыс [11] .Уровень карбонилированных белков, характеризующих окислительный стресс, повышался в плазме крови у восприимчивых к гипоксии крыс Sprague-Dawley сразу после третьего гипоксического воздействия на высоте, соответствующей 9754 м, что было более значительным, чем у толерантных крыс [127]. Низкий уровень карбонилированных белков в плазме крови после трехкратного воздействия гипоксии на экстремальной высоте с интервалом в неделю был использован в качестве маркера толерантности к гипоксии [127]. Нами также показано, что через 90 мин после однократного гипоксического воздействия на экстремальной высоте уровень маркера окислительного стресса 8-изопростана повышался в сыворотке крови только у восприимчивых к гипоксии крыс [194].

В работе [228] проведен протеомный анализ белков плазмы крыс, подвергшихся гипоксии на высоте 7620 м в декомпрессионной камере, и было идентифицировано 25 белков, экспрессия которых изменялась при гипоксии. Большинство обнаруженных белков были связаны с клеточными защитными механизмами, включающими противовоспалительную и антиоксидантную активность. Несмотря на то, что ни один из белков сам по себе определенно не связан с гипобарической гипоксией, комбинация протеомной информации различных белков важна для лучшего понимания молекулярного пути, на который влияет гипобарическая гипоксия.Тем не менее, в этом исследовании животные не были разделены по толерантности к гипоксии. Степень изменений экспрессии исследуемых белков под влиянием гипоксии могла варьировать в зависимости от базовой толерантности к дефициту кислорода. Любой из этих фактов может быть полезен; однако цель найти маркеры толерантности к гипоксии для клинического применения и акклиматизации остается актуальной для научных исследований.

Имеющиеся данные об особенностях реакции эндокринной, антиоксидантной и других систем организмов с разной толерантностью к гипоксии позволяют предположить наличие различий в ответе других интегративных систем, в том числе иммунной и близкородственных воспалительных процессов при толерантно- и восприимчивых к дефициту кислорода животных.

Поскольку известно, что гипоксия связана с воспалением [1,2,4,46], уровень экспрессии ядерного фактора NF-κB, инициирующего воспаление, в цитозоле и ядрах кардиомиоцитов у толерантных и восприимчивых к -гипоксию крыс Sprague–Dawley изучали [14]. После трехкратного воздействия искусственной гипобарической гипоксии на высоте 9250 м в миокарде восприимчивых к гипоксии крыс снижалась цитозольная экспрессия NF-kB и возрастала ядерная экспрессия, что свидетельствует о его активации.Экспрессия провоспалительного цитокина TNFα в миокарде восприимчивых животных была выше, что также отражает активацию воспалительного ответа [14]. Нами показаны различия в выраженности индуцированных липополисахаридами (ЛПС) воспалительных реакций у самцов крыс Вистар с разной устойчивостью к гипоксии. Крысы, восприимчивые к гипоксии, характеризуются более выраженной воспалительной реакцией, индуцированной ЛПС [18,19].

Полученные данные о содержании интерлейкинов, иммуноглобулинов и гормонов в периферической крови толерантных и восприимчивых к гипоксии животных противоречивы [229,230,231].По данным [231], у толерантных к гипоксии крыс уровень ИЛ-10 в сыворотке крови был выше, чем у восприимчивых животных, а концентрация ИЛ-1β и ФНОα не различалась; однако срок эксперимента после двукратного определения толерантности к гипоксии в работе не указан. Уровень иммуноглобулинов М, G и А также не различался у толерантных и восприимчивых к дефициту кислорода крыс. В литературе приводятся данные об отсутствии различий лейкоцитарной формулы у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных, а также клеточного состава костного мозга и уровня лимфоцитов в тимусе [230].Однако в работе [230] гендерные различия не учитывались; эксперименты проводились на самцах и самках.

Поскольку в экспериментальных исследованиях используются разные линии крыс обоего пола, экстремальные высоты и критерии определения устойчивости к гипоксии существенно различаются, данные, представленные в литературе, трудно сопоставить. Сводная информация о различиях между толерантными и восприимчивыми к гипоксии крысами представлена в .

Таблица 2

Суммарные изученные различия между толерантными и восприимчивыми к гипоксии животными в зависимости от методов определения.

92
Более высокий уровень NO

Мишени	Методы	Толерантные	Восприимчивые	Ref.
Клетки коры головного мозга	Через месяц после однократного измерения толерантности к гипоксии ЦОГ1 и сукцинат	Меньшее количество митохондриальных крист	[17,21]
Клетки печени		Более высокая скорость АТФ-зависимого транспорта K+ в митохондриях Более высокая способность удерживать 5 Ca 201+ в митохондриях 901		[9,22]	[9,22]	[9,22]

клетки печени и сердца	Более высокий уровень Ca ²⁺ поглощение Mitochondria	более высокое количество K + в Mitochondria	[9,22]
плазма крови	Сразу после однократного измерения толерантности к гипоксии	Повышение уровня норадреналина, АКТГ и тестостерона	Повышение уровня пролактина	[126]
плазма крови	Немедленно после трех последовательных экспозиций на экстремальной высоте	Более высокий уровень эндотелина-1, кортикостерона, АФК и карбонилированных белков	[14,127]
Миокард	Сразу после трех последовательных экспозиций на большой высоте и супероксиддисмутазы	2 926 Более высокие уровни NO, эритропоэтина и активности eNOS и iNOS Более высокие экспрессии HIF-1α, GLUT1, HSP27, HSP60, HSP70 и HSP90	Повышенная активность каспазы-3, уровень малонового диальдегида, АФК, карбонилированных белков, экспрессия эндотелина-1 и VEGF, ядерная экспрессия NF-kB, и экспрессия TNFα	[11,12,14]
Сыворотка крови	Через 5 мин после однократного гипоксического воздействия на экстремальной высоте	Повышенное содержание VEGF, эритропоэтина и TGF-β		[194]
	90 мин после однократного гипоксического воздействия на предельной высоте		Повышенное содержание TGF-β, уровень маркера оксидативного стресса 8-изопростана	[194]
	После двойного определения толерантности к гипоксии	Повышенный уровень ИЛ-10 в сыворотке		[231]
Печень и неокортекс	5 мин после однократного гипоксического воздействия на большой высоте	Повышенная экспрессия HIF-1 и NF-kB		[194]
Печень и неокортекс	Через месяц после однократного измерения толерантности к гипоксии		Более высокий уровень HIF-1	[13,18]

Общепринято проводить эксперименты в течение одного месяца после измерения толерантности к гипоксии, но это представление не полностью обосновано.Без методики определения устойчивости к дефициту кислорода без декомпрессионной камеры выяснить, являются ли различия некоторых показателей, выявленные у толерантных и восприимчивых к гипоксии животных, предсуществующим признаком или следствием гипоксического воздействия, не представляется возможным. В дальнейшем необходимо провести дальнейший поиск биомаркеров устойчивости к гипоксии без воздействия высокогорья и изучить различия течения воспалительных и опухолевых заболеваний у организмов с разной чувствительностью к дефициту кислорода.

Роскошная невеста на озере Комо

Этот блог изначально был опубликован на Wedding Sparrow

Не поймите нас неправильно — у нас всегда будет слабость к классическим румянам и зеленым свадьбам, но на самом деле нет ничего, что мы любим больше, чем когда невеста не боится быть смелой с цветом! С помощью планировщика Bespoke Unique Weddings и цветочного дизайнера The Garden of Love эта великолепная редакционная статья об озере Комо объединила живые оттенки очаровательных садов виллы Пиццо, позволив им вдохновить на создание действительно единственной в своем роде цветовой палитры.Яркие всплески розового и песочно-желтого цветов танцевали от церемонии на берегу озера до приема в шатре, и все это было снято Ольгой Макаровой на пленку!

«Великолепная вилла Пиццо с захватывающим видом на озеро Комо, цветы в летнем саду, расшитое бисером платье, тщательно подобранный стол, расписные вуали… хотите большего? Все продавцы справились и сотворили свое волшебство на этой стилизованной съемке.

Свадебный переполох Валентина из Bespoke Unique Weddings и фотохудожник Ольга Макарова черпали вдохновение в акварельных картинах в современной интерпретации. Он был минималистичным по своей сути, но наполнен эфирными штрихами. Уникальные детали ручной работы Grigio Cielo Studio дополняют каждую сцену: драпировки для места церемонии, салфетки для завершения сервировки стола, платки в качестве свадебных сувениров и рисунки на канцелярском костюме. На невесте было два совершенно романтичных платья из капсульной коллекции Le Fate Milano: одно из бисера для церемонии и более современное и легкое для торта.Безупречный макияж и прическа от A&Co. Свадебная красота. Мы выбрали светлые тона и легкие текстуры, чтобы создать чувственную современную женщину. Образ был красиво подчеркнут причудливыми свадебными аксессуарами от Nea Milano и изысканным обручальным кольцом с розовым турмалином от Linea Laboratorio Orafo. Экологически чистые цветочные композиции от The Garden of Love с использованием местных садовых цветов в палитре персика и светлого апельсина отражали природную красоту виллы Пиццо. Для создания композиций не использовалась флористическая пена.Мы выбрали фрукты и непринужденные центральные предметы, чтобы украсить расслабленный стол, и богатую деталями одежду для ужина от Table Set Rentals, чтобы добавить немного элегантности и романтики. Весь день запечатлел Владимир Царь с Artlook».

ДАННЫЕ О ПОСТАВЩИКЕ

границ | Изучение разнообразия бактерий и свободноживущих простейших в биопленках труб горячего водоснабжения многоквартирных домов г. Риги (Латвия)

Фон

Биопленки представляют собой скопления микроорганизмов, встроенных в слизистую матрицу, где они взаимодействуют друг с другом, чтобы лучше адаптироваться к различным факторам окружающей среды и выжить (Mahapatra et al., 2015). На самом деле известно, что большинство бактерий в системах водоснабжения находятся в биопленках, а не в водной фазе (Mahapatra et al., 2015). Биопленки бытовых водопроводных труб могут быть причиной широкого спектра проблем с качеством воды и эксплуатационными проблемами, поскольку микроорганизмы в биопленках, как правило, проявляют большую устойчивость к антибиотикам и дезинфицирующим средствам. Таким образом, биопленки представляют собой потенциальный резервуар для патогенов, в том числе нескольких родов, принадлежащих к бактериальным типам Proteobacteria (e.g., роды Pseudomonas, Klebsiella, Aeromonas ), Actinobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia, Nitrospirae и Bacteroidetes (Liu et al., 2013), из которых Firmicutes являются доминирующими грамположительными бактериями ., 2004) и Proteobacteriare представляют основной тип грамотрицательных бактерий (Vaz-Moreira et al., 2017). Протеобактерии spp. включают также хорошо известный респираторный патоген — L. pneumophila — который может передаваться человеку при вдыхании загрязненных капель воды, вызывая болезнь легионеров (Abu Khweek and Amer, 2018).

До сих пор остается спорным вопрос о том, свободно ли сохраняются Legionella spp в биопленках, разрастающихся до большого количества, или в различных свободноживущих простейших (FLP). потенциальных хозяев FLP, а также концентрацию Legionella spp , так как при достижении высоких концентраций в их хозяевах Legionella может выделяться в различных формах, включая свободные клетки, клетки внутри фрагментов биопленки или секретируемые везикулы.Более того, в течение своего жизненного цикла L. pneumophila переключаются между различными репликативными, инфекционными и покоящимися формами в качестве приспособления к изменениям окружающей среды, поэтому для их репликации в основном требуются FLP-хозяева. Теплая температура воды, стоячая вода с избытком питательных веществ, отсутствие химических дезинфицирующих средств, а также некоторые поверхностные материалы — вот некоторые из условий, которые способствуют росту и влияют на сложные взаимодействия внутри биопленок, включая связанный с ними FLP и, следовательно, Legionella spp. .(Академии, 2019).

В этом исследовании мы стремились оценить разнообразие бактерий и ФЛП и реконструировать возможные сети совместного появления в пределах 45 биопленок труб горячей воды, собранных в нескольких многоквартирных домах в Риге, столице Латвии, с акцентом на наличие л.пневмофила .

Методы

Коллекция образцов

Сорок пять образцов биопленки были взяты с внутренней поверхности труб в системах распределения горячей воды 43 (т.е. два дома были дублированы) многоквартирных домов в Риге (столица Латвии) во время ремонтных работ в мае и июне 2017 года. Мы также собрали дополнительную информацию об окружающей среде, т. е. температуру воды в соответствующей трубе, возраст и тип трубы, а также возраст соответствующего здания, как показано в таблице 1 и дополнительной таблице S1.Все трубы были изготовлены из оцинкованной стали, а возраст трубопроводной системы колебался от 11 до 60 лет, тогда как измеренная температура воды колебалась от 37 до 57°C. Все пробы отбирались из жилых домов и квартир, поэтому можно предположить регулярную циркуляцию воды в опробованных трубах. Температура воды измерялась в момент отбора проб контактным термометром на внешней поверхности трубы. Возраст многоквартирных домов варьировался от 27 до 128 лет, а этаж здания, с которого были собраны образцы биопленки, варьировался от цокольного до 14-го этажа.Собранные трубы были доставлены в лабораторию в герметичных мешках в течение дня, чтобы предотвратить их высыхание, которое могло поставить под угрозу жизнеспособность микроорганизмов. В лаборатории трубы разрезали на куски длиной 5 см с помощью угловой шлифовальной машины, и материал биопленки осторожно удаляли скальпелем с внутренней стороны каждого фрагмента трубы. Собранный материал осторожно измельчали в стерильной ступке пестиком до разрушения соберите большие куски и тщательно перемешайте каждый образец перед разделением на аликвоты для отдельных анализов.Полученный материал состоял либо из влажного порошка, либо из твердых частиц, которые визуально содержали некоторое количество продуктов коррозии (см. Дополнительный рисунок S1).

Таблица 1 . Экологическая информация о 45 образцах биопленки, собранных с внутренних поверхностей труб в системах горячего водоснабжения многоквартирных домов в Риге (столица Латвии) во время ремонтных работ в мае и июне 2017 года.

Бактериальный анализ

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяли при 22 ± 1°С в соответствии с методикой стандарта качества ISO 6222:1999, за исключением того, что для разведения вместо пептонного разбавителя использовалась стерильная вода.Вкратце, 1 г каждого образца биопленки разбавляли (1:10). Из них 1 мл высевали на агар с дрожжевым экстрактом и инкубировали в течение 72 часов. Численность L. pneumophila в соответствующих образцах определяли в соответствии с принципами ISO 11731:2017 и нормализовали на 1 г сухого веса. В частности, 0,1 мл вышеупомянутого разведения инокулировали на основную среду, забуференный угольно-дрожжевой экстрактный агар с L-цистеином, пирофосфатом железа (III) и селективными добавками (BCYE+AB) (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Италия).Инкубацию проводили при 36 ± 1 °С в течение 10 дней. Колонии, подобные Legionella spp., переносили на агар BCYE и агар BCYE-Cys (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Италия) и планшеты инкубировали при 36 ± 1 °C в течение 2 дней. Предел обнаружения для Legionella spp. культивирование было рассчитано как 100 КОЕ г ^-1 . Виды колоний, подобных Legionella spp., были подтверждены на масс-спектрометре Autoflex Speed MALDI-TOF (Bruker Daltonics). л.pneumophila серогруппы определяли с использованием латексного моноклонального реагента Prolex ^TM Legionella pneumophila серогруппы 1 и латексных поликлональных реагентов Prolex ^TM Legionella pneumophila серогрупп 2-14 (Pro-Lab Diagnostics, Канада) в соответствии с рекомендациями производителя.

Морфологическая идентификация свободноживущих простейших

Наш метод культивирования FLP был таким же, как описано у Vaerewijck et al. (2010). Чтобы обеспечить рост и размножение FLP, в каждую чашку Петри, содержащую 300 мг неразбавленного образца биопленки, добавляли 15 мл жидкой солевой среды для амеб Пажа (PAS) с двумя стерилизованными зернами риса.Все планшеты инкубировали в течение 4–5 дней при 25°С. После этого каждую чашку Петри исследовали под световым микроскопом (пару примеров см. на дополнительном рисунке S2). Для дальнейшего увеличения биомассы FLP в каждую чашку Петри добавляли дополнительные 15 мл среды PAS, дополненные 70 мкл жидкой среды Peptone дрожжи-глюкоза (PYG). Из-за небольшого количества добавленной среды PYG можно было избежать чрезмерного роста бактерий. Затем последовал еще один цикл инкубации в течение 4–5 дней при 25°C и повторное исследование под световым микроскопом на наличие FLP, которые затем были таксономически классифицированы на основе морфологических наблюдений, как описано Vaerewijck et al.(2010).

Экстракция ДНК и секвенирование ампликона 16S/18S рРНК (метатаксономика)

Микробную ДНК экстрагировали из 250 мг каждого образца биопленки с использованием набора DNeasy PowerSoil (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве отрицательного контроля экстракции использовали воду, не содержащую нуклеаз и ДНК. Вместо образца биопленки использовали воду, не содержащую нуклеаз и ДНК, в качестве дублирующего отрицательного контроля выделения ДНК. Эти два отрицательных контроля подвергались совместной обработке на протяжении всего процесса подготовки библиотеки, секвенирования и таксономического распределения.Оба отрицательных контроля работали, как и ожидалось, и значительного фонового загрязнения не наблюдалось. Библиотеки для секвенирования ампликонов 16S рРНК были подготовлены в соответствии с Руководством Illumina по подготовке библиотеки метагеномного секвенирования 16S (часть документа № 15044223 Rev. B), в котором используются праймеры SD-Bact-0341-bS. -17 и SD-Bact-0785-aA-21 от Klindworth et al. (2013) для амплификации фрагмента длиной 464 п.н. областей V3-V4 бактериального гена рРНК 16S рибосомной РНК. Во все реакции ПЦР добавляли 1 мг мл ^-1 бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения ингибирования.Набор MinElute PCR Purification Kit (Qiagen) использовали для удаления BSA перед очисткой магнитными гранулами SPRI. Библиотеки для секвенирования ампликонов эукариотических рРНК 18S готовили аналогичным образом, за исключением того, что использовались другие праймеры и условия ПЦР. Для амплификации гипервариабельной области V4 гена 18S рРНК использовали прямой праймер Reuk454FWD1 (Stoeck et al., 2010) и обратный праймер V4 (Bradley et al., 2016) с выступающими концами адаптера Illumina. Условия ПЦР для амплификации фрагмента гена 18S рРНК были следующими: 95°С 5 мин, 14 циклов 98°С 30 с, 57°С 45 с и 72°С 1 мин, 21 цикл 98°С. 30 с, 47°С 45 с и 72°С 1 мин, с окончательным удлинением при 72°С 5 мин.Только образцы с обнаруживаемым продуктом ПЦР подвергались дальнейшей обработке и секвенированию. Секвенирование ампликона проводили с использованием платформы Illumina MiSeq и наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v3 и MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina, Сан-Диего, США), генерируя 2 x 300 п.н. и 2 x 250 п.н. комплект v2 использовали только для библиотек ампликонов 18S рРНК). Необработанные данные о последовательностях доступны в базе данных Европейского нуклеотидного архива (ENA) под номерами доступа PRJEB27134 (45 образцов, для которых было выполнено секвенирование ампликона 16S рРНК) и PRJEB31264 (12 образцов, для которых было выполнено секвенирование ампликона 18S рРНК).

Секвенирование ампликона 16S/18S рРНК (метатаксономическое) Обработка данных

Анализ данных секвенирования ампликона 16S рРНК

(метатаксономический) был выполнен с использованием рабочего процесса Illumina 16S Metagenomics (v2.6.2.3.), доступного в программном обеспечении MiSeq Reporter. Общее количество прочтений секвенирования варьировалось от 31 109 до 284 706 на образец (в среднем 103 605 прочтений на образец). Последовательности были сгруппированы в OTU на основе 97% идентичности, и была выполнена таксономическая классификация соответствующих OTU с использованием реализации наивного байесовского классификатора Ribosomal Database Project (RDP) (Wang et al., 2007), по сравнению с кураторской версией таксономической базы данных Greengenes. Анализ считываний секвенирования ампликона 18S рРНК (метатаксономические) выполняли в CLC Genomics Workbench v11.0.1 (Qiagen). Вкратце, за обрезкой адаптера, обрезкой качества и фильтрацией последовала субдискретизация, кластеризация OTU на основе открытых эталонов по сравнению с эталонной базой данных PR2 v4.11.1 (Guillou et al., 2012) при сходстве 97%, а также удаление химер. При интерпретации результатов учитывался порог минимальной численности 0,1%, основанный на известном 0.1 % переходящего загрязнения между запусками Illumina MiSeq (Nearing et al., 2018).

Статистический анализ

Экологический анализ сообщества биопленки

был выполнен с использованием пакета R vegan v2.5-2 (Jari Oksanen et al., 2018). Во-первых, необработанные подсчеты последовательностей были нормализованы разрежением, как это предлагается в вики-пакете, поскольку для экологического анализа сообщества потребуются числа таксономических групп. Разрежение выполнялось до наименьшего количества последовательностей в наших выборках ( n = 31,109) без замены с использованием пакета R RAM и функции OTU.разрежение (Чен, 2018). Мы рассчитали альфа-разнообразие, включая общее количество различных таксонов в каждой выборке (богатство; S), насколько равномерно распределены эти таксоны (равномерность Пьелу; J’; ограничено между 0 и 1, где 0 указывает на присутствие одного доминирующие таксоны) и общее разнообразие таксонов (индекс разнообразия Шеннона; H’), которое учитывает как общее количество, так и равномерность таксонов. S и H’ рассчитывали с использованием функций specnumber и разнообразия соответственно.Затем J’ был рассчитан как J ‘ = H ‘/ log ( S ). Корреляции Пирсона использовались для связи S, H’ и J’ с 18 факторами окружающей среды (таблица 1 и дополнительная таблица S1). Мы также рассчитали профили энтропии Реньи для каждой выборки, отражающие континуум возможных измерений шенноновского разнообразия, используя функцию renyi . Бета-разнообразие (т. е. различия Брея-Кертиса; BCD) рассчитывали с использованием функции vegdist .Чтобы оценить, какой из факторов окружающей среды (например, температура воды в трубе, возраст трубы или пол здания, из которого был взят образец; см. Таблицу 1 и Дополнительную Таблицу S1) оказывает наибольшее влияние на это изменение разнообразия таксонов между выборками, мы использовали функцию адониса с 1000 перестановок, чтобы также определить значимость ( p -Значение) этих ассоциаций. Во всех случаях для расчета коэффициента ложных открытий (FDR) использовалась поправка Бенджамини-Хохберга (BH) (Benjamini and Hochberg, 1995) для множественного тестирования.

Сетевой анализ совпадений

Мы использовали аналогичный подход, описанный Org et al. (2017) для проведения анализа сети одновременного появления бактерий. Во-первых, мы нормализовали обилие родов, рассчитав их соответствующие доли общего числа последовательностей в выборке, которые затем были преобразованы в арксинус-квадратный корень в качестве средства стабилизации дисперсии и использовались в качестве входных данных для создания сети совместного появления с использованием пакета R. WGCNA (Лангфельдер и Хорват, 2008 г.). Мы отбросили все роды, которые присутствовали менее чем в 50% наших образцов биопленок, оставив нам 272 «общих» рода (из 611 идентифицированных родов) для дальнейшего анализа.Хотя очевидно, что также (или, может быть, в частности) таксоны, присутствующие в некоторых выборках, могут предоставить очень ценную информацию с экологической точки зрения, анализ сети совместной встречаемости основан на корреляциях, поэтому включение редких OTU создаст «недостающее значение». проблема, требующая вменения, которая может иметь смысл для так называемых «небиологических нулей» (технических и выборочных нулей) (Jiang et al., 2021), однако может быть менее полезной для «биологических нулей», т. е. таксонов, которые отсутствуют в конкретных образцах.Мы реконструировали сеть со знаком, где минимальное значение бета, удовлетворяющее критериям безмасштабной топологии, было выбрано равным 6. Для функции динамического вырезания дерева мы установили в качестве параметров deepSplit = 2 и minModuleSize = 5. Чтобы связать полученные группы родов (модули) с факторами окружающей среды и присутствием L. pneumophila и их потенциальных хозяев (таблица 1 и дополнительная таблица S1), мы рассчитали корреляцию Пирсона между каждым фактором среды и так называемым модулем. собственные гены (ME), определяемые как первый основной компонент модуля, за которым следует корректировка BH (Benjamini and Hochberg, 1995) для многократного тестирования.

Функциональные предсказания

Функциональный состав модулей был предсказан с использованием их функциональных профилей на основе пангеномов, реализованных в инструменте PanFP (Jun et al., 2015), который использует все доступные полные геномы прокариот и их соответствующие таксономические классификации из Национального центра для базы данных биотехнологической информации (NCBI) [ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/] в сочетании с функциональной аннотацией из базы данных KEGG Orthology (KO) [https://www.genome.jp/kegg/ko.html]. Точный критерий Фишера использовался для расчета перекрытий между наборами генов, т. е. модульных генов и генов, аннотированных к соответствующему термину KO, с последующей поправкой BH (Benjamini and Hochberg, 1995) для множественного тестирования.

Визуализация

Совпадение встречаемости L. pneumophila у разных хозяев было визуализировано с помощью диаграмм Венна [http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/].

Результаты

Во время ремонтных работ в мае и июне 2017 года в Риге нам удалось собрать 45 образцов биопленки (пронумерованные от 1 до 47) с внутренних поверхностей труб системы горячего водоснабжения многоквартирных домов в Риге, дополненные дополнительной информацией об окружающей среде. факторы (т.g., температура воды, возраст и тип трубы), как указано в таблице 1 и дополнительной таблице S1. Помимо прочего, мы также зафиксировали географические координаты — широту и долготу — многоквартирных домов, которые в нашем случае были связаны с разными первичными источниками воды, снабжающими питьевой водой разные районы города [https://www.rigasudens]. .lv/ru/]. В частности, для северной части естественные подземные воды берутся из источника «Балтэзерс-Закюмуйжа» и дополняются водой из озера «Мазайс Балтэзерс».” Тогда как для южной части в качестве основного источника поверхностных вод используется водохранилище Рижской ГЭС на реке Даугава.

Разнообразие бактериального сообщества в биопленках труб горячего водоснабжения по оценке с помощью секвенирования ампликона 16S рРНК

Сначала мы исследовали бактериальное разнообразие 45 биопленок, используя секвенирование ампликона 16S рРНК. Мы проанализировали филогенетические вариации биопленок на разных таксономических уровнях (т. е. типа, рода и вида).

Анализ на уровне типов

Анализ

типов на уровне (рисунок 1A и дополнительная таблица S2) показал, что во всех образцах количественно наиболее распространенными типами были Proteobacteria spp.(~36,3% от общего числа последовательностей), за которыми следуют Firmicutes (~15,6%), Nitrospirae (~8,3%), Planctomycetes (~7,9%) и Actinobacteria (~3,4%) spp., дополненные второстепенными фракциями Bacteroidetes (~0,58%), Acidobacteria (~0,37%) и Cyanobacteria (~0,39%) spp. Мы также наблюдали несколько термофилов, таких как Chloroflexi (~2,9%), Thermi (~1,49%) и Thermotogae (~1,38%) spp.в наших образцах биопленки.

Рис. 1. (A) Анализ данных секвенирования ампликона 16S рРНК на уровне типов, показывающий процент каждого конкретного типа от общего числа последовательностей в каждом образце. Категория «другие» представляет собой сумму всех классификаций с содержанием менее 3,5%. Образцы сортируются по широте (с юга на север), а температура воды в соответствующей трубе отображается над каждой полосой (≥50°C красным цветом и <50°C синим цветом). (B,C) Анализ альфа- и бета-разнообразия данных секвенирования ампликона 16S рРНК (метатаксономические). (B) Профили энтропии Реньи данных секвенирования ампликона 16S рРНК, отражающие континуум возможных измерений разнообразия Шеннона (ось x). Рассчитано с использованием разреженного числа чтений. В графике используется графика Trellis с отдельной панелью для каждого образца биопленки. Точками показаны значения для соответствующей выборки, а линиями отмечены экстремумы (темно-зеленые) и медианы (пурпурные) в наборе данных. (C) Тепловая карта, отображающая отношения (кластеры) между образцами секвенирования ампликона 16S рРНК на основе расчетов расстояния Брея-Кертиса (бета-разнообразие).Он отражает межвыборочное разнообразие: 0 означает, что две выборки имеют одинаковый состав (т. е. все роды), тогда как 1 означает, что две выборки не принадлежат ни одному роду. Три большие группы биопленок с одинаковым составом обозначены 1. (красным), 2. (зеленым) и 3. (синим). Одна из групп (2. зеленая) относилась к широте, в ней преобладали образцы из южной части Риги. Обе другие группы были связаны с температурой воды. Из них в одной (1. выделено красным) в основном преобладала температура воды ≥50°C, тогда как в другой группе (3.синим цветом) преобладала температура воды <50°C.

Анализ на уровне рода

Мы определили 611 OTU, 272 из которых присутствовали как минимум в 50% биопленок и считались «ядром» для наших биопленок (дополнительная таблица S3). Из них 82 присутствовали во всех 45 биопленках, тогда как 80 других были обнаружены только в одном образце каждый (дополнительная фигура S3). Количественно 107 родов были представлены не менее чем 0,1% от общего числа последовательностей, 48 (или ~ 45%) из них принадлежали к типу Proteobacteria (дополнительная таблица S2).

Тем не менее, наиболее многочисленным был род Thermodesulfovibrio (~7,5%), принадлежащий к типу Nitrospira . За ним сопровождалось фенилобактерия (~ 2,9%; phylum протеабактерии ), Moorella (~ 2,7%; филум укрепляет ), GEMMATA DESCURIGLOBUS (~ 2,6%; PHYLUM Planctomycetes ) и Rhodoplanes (~ 2,5%; тип Proteobacteria ). Legionella spp. (тип Proteobacteria ) был обнаружен в 44/45 биопленках (дополнительная таблица S3), однако его численность была низкой, составляя в среднем только 0.58% от общего числа последовательностей (дополнительная таблица S3).

Анализ альфа-разнообразия

Затем мы рассчитали несколько индексов, изучающих бактериальный ландшафт в каждой биопленке (так называемое альфа-разнообразие), включая богатство (S), равномерность Пьелу (J’), индекс разнообразия Шеннона (H’) и профили энтропии Реньи. для каждого образца (определения см. в разделе Материалы и методы). Следует отметить, что хорошо известно, что полный спектр таксонов в образце редко бывает насыщенным и увеличивается с увеличением глубины секвенирования (Weiss et al., 2017). Действительно, также в наших данных, как S, так и H’ значимо положительно коррелировали ( R = 0,7, P = 1,3 x 10 ^-8 и R = 0,4, P = 5,3 x 10 ^-3 соответственно), с общим количеством последовательностей в каждой биопленке, только J’ не зависит от количества последовательностей ( R = 0,24, P = 0,1; дополнительная фигура S4). Следовательно, мы сократили количество необработанных последовательностей и повторили анализ (дополнительная таблица S4) и разделили все индексы на квантили, создав четыре группы сравнения (дополнительная таблица S4), включая самые высокие, выше среднего, ниже среднего и самые низкие индексы разнообразия, соответственно.

У нас также было две параллельные пары образцов, взятые из одного и того же здания: биопленки 7 против 47 и 27 против 37, что позволило нам сравнить разнообразие биопленок в пределах одного здания. Мы заметили, что S колеблется от 184 (биопленка 45) до 289 (биопленка 35) со средним значением ~ 224. Биопленки 7 и 37 относились к самой низкой группе S, тогда как биопленки 47 и 27 относились к группе ниже средней (дополнительная таблица S4), что позволяет предположить, что богатство родов может варьироваться даже в пределах одного здания. J’ варьировался от 0.45 (биопленка 16) до 0,71 (биопленка 22) при среднем значении 0,62, что свидетельствует о достаточно равномерном распределении родов, т. е. об отсутствии тенденции к одному доминирующему роду. H’ колебался от 2,40 (биопленка 16) до 4 (биопленка 22) со средним значением ~ 3,40. Биопленки 27 и 37 находились в самых высоких группах J’ и H’, тогда как биопленка 7 находилась в группе ниже и выше среднего, соответственно, но биопленка 47 находилась в группе ниже среднего в обоих случаях (дополнительная таблица S4), что снова предполагает что даже в пределах одного здания биопленочные ландшафты могут различаться.При сравнении профилей энтропии Реньи для каждого образца (рис. 1В) мы заметили, что биопленки 22, 33 и 44 демонстрировали более высокое разнообразие по сравнению со всеми другими биопленками, тогда как биопленка 16 была менее разнообразна, в соответствии с наблюдениями из H’ и J’ расчеты. Измерения разнообразия для двух пар образцов одного и того же здания (т. е. биопленки 7 против 47 и 27 против 37) были схожими. Наконец, мы исследовали, продемонстрировали ли показатели альфа-разнообразия (S, H’ и J’) значительную корреляцию с 18 признаками окружающей среды.H’ и J’ положительно коррелировали ( R = 0,3) с возрастом трубы ( P < 0,04), однако обе корреляции не были значимыми при FDR 5%.

Анализ бета-разнообразия

Затем мы рассчитали бета-разнообразие, то есть расстояние между образцами микробного состава или расстояние Брея-Кертиса (BCD; рисунок 1C), которое колеблется от 0 до 1, где 0 означает, что два образца имеют одинаковый состав (т.е. , разделяют все роды), тогда как 1 означает, что две биопленки не принадлежат ни одному роду.В наших образцах BCD колебался от 0,2 (биопленки 1 и 10, 20 и 46) до 0,9 (биопленки 11 и 29) со средним значением 0,64, что позволяет предположить, что наши биопленки были довольно несходны по своему родовому составу. Биопленки 19 и 11 имели самые высокие средние значения BCD по сравнению со всеми другими биопленками — 0,8 и 0,79 соответственно, за ними следуют биопленки 45 и 26 со средним значением BCD 0,74 и 0,72 соответственно. В целом можно выделить три большие группы биопленок, имеющих сходный состав (рис. 1С).Было предсказано, что температура воды ( F = 4,1, P < 0,001) и широта (т. е. различные первичные источники воды) ( F = 5,6, P < 0,001) окажут наиболее значительное влияние (при FDR 5). %) на изменения BCD (дополнительная таблица S5).

Подсети (модули) бактериальной совместной встречаемости и их связь с признаками окружающей среды

Чтобы идентифицировать подсети (модули) бактерий, встречающихся вместе (т. е. OTU, демонстрирующие одинаковую численность в образцах биопленки) и выяснить их связь с признаками окружающей среды (таблица 1 и дополнительная таблица S1), мы использовали взвешенный генный co сетевой анализ экспрессии (WGCNA) (Langfelder and Horvath, 2008) для реконструкции сети совместно встречающихся родов и идентификации модулей в этой сети, аналогично тому, как ранее описано Org et al.(2017). Следует отметить, что мы рассмотрели только 272 наиболее «обычных» рода, присутствующих не менее чем в 50% наших биопленок (дополнительная таблица S3), и рассчитали так называемый «хаб» каждого модуля, т. е. самый центральный род (см. Модуль описание членства (MM) ниже). Этот анализ дал 10 модулей (рис. 2А и дополнительная таблица S6), каждому из которых было присвоено произвольное название цвета — черный: (14 родов; Thermodesulfatator ), синий (28 родов; Exiguobacterium ), коричневый (24 рода; Blastochloris ), зеленый (22 рода; Meiothermus ), пурпурный (13 родов; Ammonifex ), розовый (14 родов; Hydrogenophaga ), пурпурный (11 родов; Desulfosarcina ); красный (16 родов). Thioalkalivibrio ), бирюзовые (51 род; Hyphomicrobium ) и желтые (24 рода; Alishewanella ).Серый модуль объединил 55 родов, которые нельзя было сгруппировать в какое-то конкретное сообщество. Legionella spp. был частью бирюзового модуля (дополнительная таблица S6).

Рисунок 2 . Реконструкция сети сосуществования бактерий и идентификация модулей с использованием анализа сети взвешенной корреляции (WGCNA; Langfelder and Horvath, 2008). Этот анализ дал 10 модулей (дополнительная таблица S6), каждому из которых было присвоено произвольное название цвета: черный, синий, коричневый, зеленый, пурпурный, розовый, фиолетовый, красный, бирюзовый и желтый. (A) Дендрограмма кластеризации родов с назначенными цветами модуля и отображением наиболее центрального рода (по оценке с использованием расчетов членства в модулях (MM)). (B) Тепловая карта, визуализирующая силу и значимость корреляции Пирсона (номинальное значение p ) ассоциаций сетевых модулей совместной встречаемости 10 родов бактерий с 18 признаками окружающей среды (таблица 1 и дополнительная таблица S1). SG, серогруппа; МАФАМ – мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; FLP, свободноживущие простейшие. (C) Дендрограмма взаимосвязей между модулями совместной встречаемости родов бактерий.

Затем мы суммировали каждый модуль по собственному гену модуля (ME), который является первым основным компонентом модуля, отражающим большую часть вариаций численности родов в этом конкретном модуле. Эти значения модуля ME затем были сопоставлены (критерий корреляции Пирсона) с признаками окружающей среды (рисунок 2B и дополнительная таблица S7). Модуль Legionella spp., содержащий бирюзу, был самым большим модулем (51 род) и продемонстрировал очень значимый отрицательный результат ( R = –0.54, P = 1,4 x 10 ^-4 , при FDR 5%) корреляции с температурой воды, что согласуется с мезофильной природой Legionella spp. Менее значимые (при FDR 25%) положительные связи наблюдались с возрастом трубы ( R = 0,32, P = 0,03) и широтой, т. е. с разным источником воды ( R = 0,37, P = 0,01). Другой модуль, демонстрирующий весьма значимые (при FDR 5%) отрицательные корреляции с температурой воды ( R = –0.44, P = 2,3 x 10 ⁻³ ) был синим модулем. Однако она также отрицательно ( R = –0,33, P < 0,03, при FDR 25%) коррелировала с широтой. На самом деле бирюзовый и синий модули были тесно связаны друг с другом и являлись частью одного и того же метамодуля (рис. 2С). Напротив, коричневый модуль показал самую сильную и наиболее значимую положительную корреляцию с температурой воды ( R = 0,51, P = 3,4 x 10 ^-4 при FDR 5% (рисунок 2B и дополнительная таблица S7) и был отрицательным ( R = –0.32, P = 0,03, при FDR 25%), что коррелирует с широтой, т.е. с исходной водой.

Далее мы изучили две метрики, предоставленные WGCNA для определения приоритета рода в каждом модуле: значимость рода (GS) и принадлежность к модулю (MM). GS определяется как корреляция между численностью рода и соответствующей интересующей характеристикой окружающей среды (например, температурой воды), таким образом обеспечивая меру релевантности этого конкретного рода вариации этого признака. MM рода указывает, насколько сильно численность конкретного рода коррелирует со всеми другими родами в этом модуле, т.е.т. е. насколько тесно род «связан» со всеми остальными родами из этого модуля. Высоко «связанные» или «хабовые» роды, как правило, имеют высокие значения MM, тогда как низкие значения MM указывают на ориентацию к периферии модуля. Три вышеупомянутых модуля — бирюзовый, синий и коричневый — продемонстрировали самую высокую корреляцию с температурой воды (дополнительный рисунок S5). В бирюзовом модуле верхние роды, наиболее значимо (при FDR 5%), отрицательно коррелирующие с температурой воды (дополнительная таблица S7), были Desulfovibrio (0.17% от общего количества; R = -0.62, p = 5,2 x 10 ^-6), Leptolyngbya (0,16% от общего числа; R = -0.61, p = 5,9 x 10 ^-6) и Hyphomicrobium (0,73% от общего количества; R = –0,53, P = 1,5 x 10 ^–4 ), последний также является «хабовым» родом модуля (MM = 0,82, P = 8,7). x 10 ⁻¹² , при FDR 5%).

Прогнозирование функциональных профилей биопленок труб с горячей водой

Чтобы также предсказать потенциальное функциональное значение проанализированных биопленок, мы выполнили реконструкцию их предполагаемых генов/белков и путей на основе пангенома, используя инструмент PanFP (Jun et al., 2015) и определили чрезмерно представленные пути (при FDR 5%) в трех представляющих интерес модулях (рисунок 3 и дополнительная таблица S8). Как видно из рисунка 3, пути, представленные значительно чаще во всех модулях, включали «Формирование биопленки», систему межклеточной коммуникации, «Чувство кворума», «Компоненты системы бактериальной секреции» и «Транспортеры», а также «Бактериальная подвижность и хемотаксис» и «Биосинтез липополисахаридов». Кроме того, мы наблюдали обогащение различных метаболических активностей, включая «фиксацию углерода», а также «обмен серы», «азот» и «обмен метана».В то же время несколько путей были чрезмерно представлены только в одном или двух из трех модулей. Например, бирюзовый модуль был обогащен генами/белками, связанными с «легионеллезом», тогда как синий и коричневый модули продемонстрировали обогащение путями, связанными с «бактериальными токсинами» и «ростом клеток» (дополнительная таблица S8).

Рисунок 3 . Реконструированный пангеномом анализ обогащения функциональным белком для модулей совместного появления бактериальных родов синего, коричневого и бирюзового, отображающий самый центральный род модуля [как рассчитано по показателю принадлежности к модулю (MM)] в подписи к рисунку.Ось x демонстрирует отношение шансов точного критерия Фишера, т. Е. Вероятность того, что род будет частью бирюзового, синего или коричневого модулей соответственно, при этом он будет аннотирован соответствующим термином KO (ось Y).

Разнообразие эукариотических сообществ в биопленках труб горячего водоснабжения по оценке секвенирования ампликона 18S рРНК

Наконец, мы также исследовали разнообразие эукариотических сообществ в 12 из 45 биопленок (только 12 образцов продуцировали обнаруживаемые ПЦР-ампликоны, которые можно было секвенировать) с использованием секвенирования ампликонов 18S рРНК.Мы определили 248 OTU, которые могут быть классифицированы как Eukaryota согласно справочной базе данных PR2 (Guillou et al., 2012; Supplementary Table S10), из них: Archaeplastida : 121, Opisthokonta : 44, Amoebozoa : 22, SAR Supergroup ( Stramenopiles : 13, Alveolata : 6 и Rhizaria : 38), а также Excavata : 2, APUSOZOA : 1 и EUKARYOTA_X (не классифицировано): 1 (рисунок 4а) . Архепластиды составляют основную группу эукариот, состоящую из наземных растений, зеленых и красных водорослей и небольшой группы, называемой глаукофитами.Opisthokonta, ранее называвшаяся группой Fungi/Metazoa, представляет собой обширную группу эукариот, включающую как царство животных, так и царство грибов. Ризарии представляют собой богатую видами супергруппу, состоящую в основном из одноклеточных эукариот. Amoebozoa и Alveolata объединяют амебоидных протистов и протистов соответственно. Stramenopiles или Heterokonta включают в основном водоросли и паразитические оомицеты. Excavata содержит множество свободноживущих и симбиотических форм, а также включает некоторых важных паразитов человека. Apusozoa включает жгутиковых эукариот, встречающихся в почве и водной среде, где они питаются бактериями (Guillou et al., 2012).

Рисунок 4. (A,B) Различные основные группы (группы уровня царства или супергруппы) эукариот, идентифицированные в данных секвенирования ампликона 18S рРНК (метатаксономические). (A) Круговая диаграмма, показывающая пропорции каждой основной группы всех выявленных операционных таксономических единиц (OTU). (B) Гистограмма, показывающая пропорции каждой основной группы всех OTU для каждой выборки отдельно. (C) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между присутствием L.pneumophila и ее потенциальные хозяева (Acanthamoeba , Filamoeba, Flamella, Vermamoeba и Vahlkampfia spp.) в данных секвенирования ампликонов 16S/18S рРНК по сравнению с обычными культуральными анализами.

Анализ альфа-разнообразия

Как и в случае данных секвенирования ампликона 16S рРНК, мы рассчитали несколько индексов, исследующих альфа-разнообразие, такие как S, J’, H’ и профили энтропии Реньи для каждого образца биопленки, рассматривая вместе все девять эукариотических супергрупп.S колебалась от 3 (биопленка 42) до 86 (биопленка 35) со средним значением ~20 на образец биопленки. J’ колебался от 0,12 (биопленка 42) до 0,76 (биопленка 35) при среднем значении 0,44. H’ колебался от 0,12 (биопленка 42) до 3,38 (биопленка 35) со средним значением 1,26. Мы не обнаружили значительных корреляций для этих показателей с 18 факторами окружающей среды, перечисленными в таблице 1 и дополнительной таблице S1. При ограничении нашего анализа фагоцитирующими свободноживущими протистами (то есть за исключением Opisthokonta , таких как Fungi и Metazoa и Archeaplastida ), количество таксонов уменьшилось с 0 (биопленка 42) до 20 (биопленка 35). , со средним значением ~ 6 на образец биопленки.J’ варьировал от 0 (биопленка 42) до 0,8 (биопленка 2) со средним значением 0,42. H’ варьировал от 0 (биопленка 42) до 2,14 (биопленка 35) со средним значением 0,79.

Анализ бета-разнообразия

Затем мы рассчитали BCD для данных секвенирования ампликона 18S рРНК, снова сначала рассмотрев все девять эукариотических супергрупп вместе. BCD варьировался от 0,71 (биопленки 2 и 3) до 1 (например, биопленки 2 и 19, 2 и 42, 3 и 42, 4 и 19, 13 и 42, 19 и 42) со средним значением 0.96, предполагая, что сравниваемые биопленки существенно различались по своему эукариотическому составу, в частности, биопленка 42 демонстрировала BCD от 1 до четырех других образцов. Для фагоцитирующих свободноживущих протистов BCD колебался от 0,7 (между образцами биопленки 4 и 15) до 1,0 (например, между образцом биопленки 42 и всеми остальными образцами, а также между образцами биопленки 2 и 3, 2 и 13, 2 и 19, 3 и 12, 3 и 35, 4 и 19) со средним значением 0,96, что снова указывает на разный состав фагоцитирующих свободноживущих протистов в образцах биопленки.

В целом, распределение различных групп эукариот не было однородным в образцах биопленки (рис. 4B): Archaeplastida сильно доминировала в двух (биопленки 26 и 35) образцах биопленки и присутствовала в изобилии еще в двух биопленках (биопленки 4 и 22). В то же время в четырех других образцах биопленок (биопленки 13, 15, 19 и 42) его обнаружить не удалось. Alveolata в основном присутствовала в образцах биопленки 13 (в основном Paraschneideria metamorphosa: 3,6% от общего количества) и 22 (в основном Gregarines XX sp.: 3,5% от общего количества), Amoebozoa в основном обнаруживались в биопленке 4, а также в меньшем количестве в образцах биопленки 19, 15, 13, 26, 22, 2 и 3, и доминировали Mb5C-линии X sp. в шести (50%) биопленках: 38,5% (4), 6,8% (15), а также <1% от общего числа последовательностей в биопленках 2, 3, 12 и 22. В пяти других образцах биопленок Echinamoeba exundans были обнаружено: 9,4% (биопленка 19) и <1% в образцах биопленки 2, 3, 13 и 22. Vermamoeba vermiformis присутствовал в следующих четырех образцах биопленки: >3.4% (13), >1,3% (22) и <1% в образцах биопленки 3 и 12. Несколько репрезентативных последовательностей (<1%) Vermamoeba и Echinamoeba были идентифицированы в нескольких образцах биопленки. Filamoeba был обнаружен в пяти биопленках: 4,3% (биопленка 26) и <1% в образцах биопленки 3, 13, 19 и 22 (дополнительная таблица S10). Excavata ( Vahlkampfiidae ) присутствовали в девяти биопленках (75%), в четырех из них (биопленки 15, 19, 22 и 25) >1%, тогда как в пяти (биопленки 2, 3, 4, 13 и 26) <1% от общего числа последовательностей.Наконец, при сравнении одновременного появления L. pneumophila и его потенциальных хозяев ( Acanthamoeba, Filamoeba, Flamella, Vermamoeba и Vahlkampfia ), обнаруженных с помощью обычных культуральных анализов и секвенирования (рис. 4C и дополнительные Таблица S10), мы идентифицировали два образца биопленки (биопленки 15 и 22), где Legionella spp. и FLP были обнаружены вместе с использованием обоих методов.

Идентификация и количественная оценка культивируемого

L.pneumophila и FLP в образцах биопленки

Нас особенно интересовало обнаружение в наших биопленках присутствия L. pneumophila и FLP ее хозяина. Методами культивирования L. pneumophila выявлено в девяти (20%) биопленках, где ее общая численность колебалась от 100 до 5600 колониеобразующих единиц (КОЕ) г ^-1 . Однако были обнаружены только серогруппы 2, 3, 6 и 9, причем преобладала серогруппа 2 (в пяти или> 55% биопленок; дополнительная таблица S1).В шести (~ 13%) биопленках FLP были обнаружены с помощью микроскопии, наиболее распространенными родами были Acanthamoeba , Vahlkampfidae и Vermamoeba (дополнительная таблица S1). Однако только в двух образцах биопленок (15 и 22, последний из самого старого — 128-летнего — здания) ФЛП (из всех трех родов) обнаружены вместе с L. pneumophila (серогруппа 9; 4400 КОЕ г ⁻¹ ).

Обсуждение

В этом исследовании, в соответствии с предыдущими наблюдениями (Paranjape et al., 2020), мы стремились провести исследование на системном уровне для дальнейшего изучения гипотезы о том, что присутствие L. pneumophila L. pneumophila может влиять как на присутствие хозяев FLP, так и на состав бактериальных сообществ бытовых труб горячего водоснабжения. и что определенные факторы окружающей среды могут демонстрировать взаимосвязь с этой структурой и подструктурой (модулями) сообщества и функциональными возможностями, указывая на потенциально системный эффект и экологическую близость, что приводит к дополнительной или конкурирующей функциональности с потенциальными последствиями для качества воды для бытовых нужд.

Очевидно, что настоящее исследование можно рассматривать в основном как описательное и оно имеет ряд ограничений. Как уже отмечалось ранее, реальные образцы биопленки обычно (также и в этом случае) получают во время ремонтных работ сетей, что создает проблемы в отношении репрезентативного отбора проб, ограниченного количества доступной биомассы, надлежащего контроля, а также исчерпывающей документации переменные среды (Fish et al., 2016). Все наши пробы были собраны исключительно с правого берега реки «Даугава», исключительно летом и только из труб с горячей водой.У нас также не хватает данных об объемных (планктонных) микроорганизмах и составе воды (питательные вещества/неорганические вещества). Мы не могли сравнивать различные материалы труб, фактор с доказанным влиянием на микробное разнообразие в биопленках (Yu et al., 2010; Lu et al., 2014; Proctor et al., 2018), поскольку все трубы были изготовлены из оцинкованной стали. . Кроме того, нам также не хватает информации о диаметре трубы и гидравлических характеристиках, напряжении сдвига и стабильности/сплоченности биопленки. Температура воды, о которой мы сообщаем, была измерена только во время отбора проб, нам не хватает информации о температуре воды при использовании, а также о колебаниях (как краткосрочных, таких как день / ночь, так и долгосрочных, т.э., лето/зима) по температуре воды. Кроме того, в будущих расследованиях необходимо будет учитывать отчеты потребителей о качестве воды. Следует отметить, что нам также не хватает функциональных данных и структурного анализа биопленок. В вычислительном отношении использование OTU вместо недавно введенных вариантов последовательностей ампликонов (ASV) (Callahan et al., 2017), а также использование или разрежение в качестве метода нормализации можно рассматривать как дополнительные ограничения. ASV предназначены для обеспечения лучшего разрешения, чем OTU (Callahan et al., 2017), а композиционный характер данных метатаксономического секвенирования может потребовать индивидуальных подходов к нормализации (Marcos-Zambrano et al., 2021; Moreno-Indias et al., 2021). Однако, как и в случае с другими новыми подходами/инструментами с открытым исходным кодом (Vilne et al., 2019), строгая оценка и сравнительный анализ ASV по сравнению с OTU, а также расчет разрежения/пропорции по сравнению с индивидуальными подходами к нормализации (Marcos-Zambrano et al., 2021 ) в разных местах, прежде чем интегрировать этот подход в рутинную реализацию анализа NGS для мониторинга и диагностического тестирования, поскольку все еще есть проблемы, которые необходимо решить, такие как недавно сообщенное наблюдение потенциального разделения одного генома на несколько отдельных. корзины, которые преувеличили бы наблюдаемое разнообразие (Schloss, 2021), e.g., для L. pneumophila , который обычно имеет несколько копий малой субъединицы рРНК (https://rrndb.umms.med.umich.edu/). Наконец, использование OTU и вычисление разрежения/пропорции позволило нам провести прямое сравнение с предыдущей литературой, в которой в основном использовались эти традиционные подходы классификации и нормализации.

Ранее был проведен ряд исследований разнообразия биопленок водопроводных труб (Yu et al., 2010; Farhat et al., 2012; Lührig et al., 2015; Махапатра и др., 2015 г.; Джи и др., 2017, 2018; Бертелли и др., 2018 г.; Фиш и Боксолл, 2018 г.; Ваак и др., 2019). Тем не менее, большинство этих исследований было проведено с помощью контролируемых лабораторных экспериментов, которые на самом деле могут не точно воспроизвести микробиоту реальной водопроводной системы, поэтому сравнения между различными исследованиями следует проводить с осторожностью (Fish et al., 2016). В нашем исследовании среднее число родов составило ~224 на биопленку, и они были распределены довольно равномерно (J’ 0.45–0.71), не обнаруживая тенденции к одному доминирующему роду. Например, Джи и др. (2017) и Waak et al. (2019) сообщили о 62 494 (H ‘из 2–6) и 41 815 OTU соответственно. Однако, скорее всего, к ним относятся и неклассифицированные. Лу и др. (2014) сообщает (Lu et al., 2014) о 125 OTU, 16 из которых с численностью >1%. Чан и др. (2019) недавно сообщили от 732 до 1100 (J’ 0,6–0,77 и H’ 4,1–5,4), Fish and Boxall (2018) 1306, а Bertelli et al. (2018) от 67 до 1038 OTU. Следует отметить, однако, что разные типы труб могут накапливать разное количество биопленки на площадь или длину трубы, поэтому меры альфа- и бета-разнообразия могут различаться в аналогичном исследовании в зависимости от того, какой параметр будет использоваться для нормализации.Следовательно, точные цифры трудно сравнивать из-за различий в экспериментальных установках, а также из-за различий в стратегиях фильтрации и отчетности. Даже при изучении параллельных пар образцов биопленок из одного здания (биопленки 7 против 47 и 27 против 37) выявлены лишь незначительные (191 против 217) или очень незначительные (202 против 210) различия в количестве родов. Джи и др. (2017) также выявили отрицательную корреляцию между H’ и температурой. Мы не наблюдали каких-либо значимых (при FDR 5%) корреляций показателей альфа-разнообразия (S, H’ и J’) и 18 признаков среды.Это говорит о том, что глубина секвенирования может на самом деле оказывать сильнейшее влияние на расчеты альфа-разнообразия биопленок, поскольку известно, что число наблюдаемых микробных таксонов увеличивается с увеличением глубины секвенирования (Weiss et al., 2017). Действительно, до разрежения мы наблюдали, что и S, и H’ значительно положительно коррелировали между собой ( R = 0,7, P = 1,3 x 10 ^-8 и R = 0,4, P = 5,3 x 10 ^{— 3} соответственно) с общим количеством последовательностей в каждом образце биопленки.

Наш анализ бета-разнообразия показал, что наибольший контраст между нашими образцами биопленок может наблюдаться между теми биопленками, которые подвергались воздействию (по крайней мере, в момент отбора проб) различных диапазонов измеренной температуры воды ( F = 4,1, P < 0,001 ) и образцы, собранные в северной и южной части участка отбора проб ( F = 5,6, P <0,001; дополнительная таблица S5), например, биопленки 19 и 11 произошли из труб со средней измеренной температурой воды <50°С.На групповом уровне 1-я группа объединила пробы из диапазона самых низких температур воды, тогда как 2-я группа включала исключительно пробы из южной части, где основным источником воды была река «Даугава». В соответствии с этим наш совместный сетевой анализ (рисунок 2 и дополнительная таблица S6) выявил три модуля, в значительной степени коррелирующих с температурой воды (дополнительный рисунок S5). Из них Legionella spp. содержащий бирюзовый модуль объединенных родов, численность которых возрастала с понижением температуры и при движении на север (рис. 2Б).Синий модуль содержал роды, численность которых увеличивалась с понижением температуры воды, а также при движении на юг. В отношении температуры воды оба модуля были очень похожи друг на друга, образуя так называемый метамодуль (рис. 2С). Коричневый модуль, напротив, объединял роды, численность которых увеличивалась с повышением температуры воды и при движении на юг (рис. 2Б). Различия в численности таксонов вдоль оси север-юг (широта), возможно, могут быть объяснены различными первичными источниками воды [https://www.rigasudens.lv/ru/]. Что касается северной части, естественные подземные воды дополняются поверхностными водами близлежащего озера. Тогда как в южной части в качестве основного источника воды используются поверхностные воды реки «Даугава». Температура воды и источник являются двумя хорошо известными факторами окружающей среды, которые существенно влияют на обилие и разнообразие биопленок водопроводных труб (Fish et al., 2016). Однако последующие исследования должны включать тщательную характеристику исходной воды, чтобы подтвердить эти корреляции.

На уровне типа мы наблюдали несколько термофилов, о которых ранее не сообщалось для систем с холодной водой, таких как Chloroflexi, Thermi и Thermotogae . Однако в остальном наши результаты (рис. 1А) согласуются с рядом других систематических исследований, изучающих микробные популяции биопленок систем водоснабжения (Ю и др., 2010; Барон и др., 2014; Махапатра и др., 2015; Douterelo et al., 2018; Van Assche et al., 2018), так как во всех наших образцах биопленок в количественном отношении наиболее распространенными типами также были Proteobacteria, Firmicutes, Nitrospirae и Bacteroidetes .Интересно, что ранее было замечено, что Proteobacteria преобладали в пробах воды из домохозяйств, которые не жаловались на качество питьевой воды, тогда как те, кто сообщал потребителям о красной воде и проточной воде с повышенным содержанием железа и марганца, заметно преобладали. больше последовательностей, представляющих Nitrospira и Pedomicrobium (в 44/45 наших образцах биопленки, в среднем 0,73% от общего количества). Однако, к сожалению, у нас нет аналогичных данных о качестве воды, чтобы проводить такие сравнения.

Мы наблюдали несколько различий на уровне рода по сравнению с холодноводными биопленками (Douterelo et al., 2018), где наиболее многочисленными родами Proteobacteria были Massilia, Pseudomonas и Sphingomonas spp. (Douterelo et al., 2018), два последних известны как условно-патогенные микроорганизмы (Baron et al., 2014). Pseudomonas spp. вместе с двумя другими патоген-содержащими родами — Acinetobacter и Klebsiella spp. также были идентифицированы как самые сильные производители биопленки в бактериальных изолятах из водопроводных труб кухонь (Mahapatra et al., 2015). Мы обнаружили лишь незначительное количество Pseudomonas (~0,15%) и Sphingomonas spp. (~0,14%), а также другие роды, содержащие переносимые через воду патогены (Baron et al., 2014) — Mycobacterium spp. (~ 0,13%). Мы не идентифицировали (>0,1% от общего числа) Massilia, Klebsiella и Acinetobacter spp. (Дополнительная таблица S3). Эти различия, возможно, могут быть связаны с измеренной температурой воды, которая, по крайней мере, в момент отбора проб в данном исследовании составляла в среднем около ~52°C.Ранее сообщалось, что повышенная температура воды (~51°C является пороговым значением) вносит значительные изменения как в филогенетический состав, так и в предполагаемые функции микробиоты в кране (Ji et al., 2017). Более того, в предыдущих исследованиях (Mahapatra et al., 2015; Douterelo et al., 2018) изучался процесс формирования и созревания биопленок с использованием контролируемых лабораторных экспериментов, тогда как мы анализировали зрелые биопленки (возрастом от 12 до 61 года; среднее значение = 36,9) в поле обучения.Различия этих биопленок могут заключаться, в том числе, и в плотности биомассы, т. е. разумно предположить, что биомасса созревающих биопленок будет ниже, чем у зрелых. Показано, что роды, содержащие условно-патогенные микроорганизмы, чаще встречались в биопленках с низкой биомассой (Proctor et al., 2018). Мы также не идентифицировали (>0,1% от общего числа) Mycobacterium, Nitrosomonas или Methylobacterium spp. (Дополнительная таблица S3), ранее было обнаружено, что в системах распределения воды преобладают хлорированные воды (Waak et al., 2019).

Интересно, что наш анализ на уровне рода показал, что два наиболее распространенных рода были фактически противоположны с точки зрения их потребности в кислороде: облигатно анаэробные Thermodesulfovibrio (~ 7,5%) против строго аэробных Phenylobacterium (~ 2,9%) spp. Такое явление можно объяснить тем, что бактерии, расположенные на внешней поверхности биопленки, обычно имеют свободный доступ к кислороду, тогда как внутри биопленки условия более анаэробные (Wang et al., 2017). Таким образом, разумно предположить, что Thermodesulfovibrio находятся в большей степени на внешней поверхности, тогда как Phenylobacterium spp. может быть расположен ближе к внутренней части биопленки. Род Thermodesulfovibrio представляет собой термофильные бактерии, обитающие в пресноводных гидротермальных средах, где они могут окислять водород и другие органические соединения посредством восстановления сульфата (Sekiguchi et al., 2008). Недавно он был идентифицирован в термальной воде и грязи в итальянском спа-комплексе с помощью секвенирования ампликона 16S рРНК (Stefania Paduano, 2017) вместе с парой других родов, также присутствующих в наших биопленках — Desulfomonile (~0.34%) и Geothermobacterium spp. (~ 0,14%). Эти сходства можно объяснить тем фактом, что в обоих исследованиях изучались реальные системы и системы горячего водоснабжения. Род Phenylobacterium хорошо известен своим чрезвычайно ограниченным спектром питательных веществ, оптимальным образом размножаясь только на ксенобиотических соединениях, таких как гербицид хлоридазон, или обезболивающих препаратах, таких как антипирин и пирамидон (Lingens et al., 1985). Ранее сообщалось, что он связан с микроводорослями Micrasterias crux-melitensis (Krohn-Molt et al., 2017), но также был обнаружен в биопленках питьевой воды (Lu et al., 2014). Следовательно, его присутствие можно объяснить тем, что поверхностные воды используются в качестве одного из источников воды, и мы наблюдаем довольно высокие доли Archaeplastida в нескольких образцах (рис. 4Б). Третьим по численности был род анаэробных и термофильных бактерий — Moorella (~2,7%), часто выделяемый из горячих источников (Слободкин и др., 1997), тогда как четвертый по численности род, Gemmata (~2,7%).6%) интересен своей необычной способностью поглощать белки из внешней среды, т. е. осуществлять «эндоцитоз» (Lonhienne et al., 2010). Следовательно, его функциональная роль в сообществе биопленок заслуживает дальнейшего изучения.

Мы использовали функциональные прогнозы на основе пангенома, чтобы получить некоторое представление о функциональных возможностях трех интересующих модулей совместной встречаемости OTU (бирюзовый, синий и коричневый) с потенциальными последствиями для качества воды для бытовых нужд и выбора мер контроля для минимизации рост биопленки.Функциональные прогнозы предполагали наличие генов/белков, связанных с такими путями, как (рис. 3) «образование биопленки» и система клеточной коммуникации «Чувствование кворума», необходимые для координации плотности сообщества в биопленке (Abisado et al., 2018). Клеточная коммуникация тесно связана с секрецией различных сигнальных молекул и реакцией на них (Abisado et al., 2018). Действительно, функциональные прогнозы предполагали наличие генов/белков, связанных с «компонентами бактериальной системы секреции» и «транспортерами», которые необходимы для транспорта питательных веществ и продуктов жизнедеятельности и, следовательно, для роста и поддержания биопленки (Wilking et al., 2013). Точно так же недавно было продемонстрировано, что «бактериальная подвижность и хемотаксис», другой предполагаемый путь, основанный на предполагаемом присутствии функциональных генов/белков, играет ключевую роль в развитии и поддержании биопленок, поскольку отдельные клетки активно двигаться к питательным веществам и искать наиболее благоприятные позиции в биопленке (Oliveira et al., 2016). Кроме того, функциональные гены/белки, связанные с «фиксацией углерода», а также с «серой», «азотом» и «обменом метана», имеют решающее значение для роста и поддержания биопленки (Fish et al., 2016), также прогнозировалось, что они могут присутствовать, что означает, что могут потребоваться более сложные и индивидуальные меры контроля, чтобы свести к минимуму рост биопленки, в зависимости от конкретного состава биопленки, а также от различных факторов окружающей среды и других присутствующих факторов. , в совокупности формируя метаболический ответ биопленки, который будет стремиться поддерживать ее целостность.

Низкая численность Legionella spp. был обнаружен в 44/45 биопленках — в среднем 0,58% от общего числа последовательностей (дополнительная таблица S3), однако есть исследования, в которых сообщается о еще более низком уровне содержания 0.003–0,3% как в хлорированной, так и в нехлорированной воде (Gomez-Alvarez et al., 2012; Liu et al., 2017; Bertelli et al., 2018). В то же время в градирнях — ведущем источнике вспышек болезни легионеров — Legionella spp. задокументирована численность 0,06–6,0% (Pereira et al., 2017). Legionella spp. входил в состав бирюзового модуля (дополнительная таблица S6), объединяющего роды, численность которых возрастала с понижением температуры воды и при движении на север (рис. 2Б), т.е.э., возможно, зависит от источника воды с увеличением содержания подземных вод. Хорошо известно, что температура воды влияет на колонизацию Legionella spp. и его присутствие в подземных водах также было задокументировано (Costa et al., 2005). Мы не идентифицировали (> 0,1% от общего числа) какие-либо виды бактерий, которые, как было обнаружено, поддерживают прилипание и рост L. pneumophila с помощью лабораторных экспериментов, включая Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium spp., Empedobacter breve, Pseudomonas putida и fluorescens (Abu Khweek and Amer, 2018). С другой стороны, мы смогли обнаружить в наших образцах несколько родов, которые могут препятствовать сохранению L. pneumophila (Abu Khweek and Amer, 2018): род Sphingomonas и Pseudomonas (~0,15% в 45 и 44/ 45 образцов соответственно), а также Burkholderia и Acidovorax (<0,5% в 45 и 20/45 образцах соответственно). Pseudomonas были частью коричневого модуля, который продемонстрировал картину корреляции, противоположную бирюзовому модулю (рис. 2B), в соответствии с ранее продемонстрированными антагонистическими взаимодействиями между Legionella и Pseudomonas spp. (Паранджапе и др., 2020). Кроме того, мы также обнаружили несколько других родов с ранее продемонстрированной антилегионеллезной активностью: Acinetobacter также был частью коричневого модуля, а Bacillus был частью синего модуля (Corre et al., 2018).

Взаимодействия хозяин-паразит Legionella spp. считаются решающими для присутствия, роста и патогенеза этих бактерий (Costa et al., 2005), и он использует обширный диапазон хозяев, охватывающий несколько типов, включая Amoebozoa (амебы), Excavata и Alveolata. (реснитчатые простейшие) (Boamah et al., 2017). В наших данных секвенирования ампликона 18S рРНК потенциальные хозяева L. pneumophila были обнаружены в 11/12 проанализированных образцах биопленки (дополнительные таблицы S10, S11), однако во многих случаях относительная численность была очень низкой (<1%; Дополнительная таблица S10).Например, Echinamoeba thethermarum ( Amoebozoa ) обнаружен в четырех биопленках. Этот вид амеб был охарактеризован как чрезвычайно теплолюбивый (Baumgartner et al., 2003) и как кандидат в хозяева для L. pneumophila (Valster et al., 2010). Другими обнаруженными подтвержденными хозяевами были Echinamoeba exundans (9,4%, в биопленке 19) (Fields et al., 1989), Vermamoeba vermiformis (0,5%, в биопленке 19) (Greub and Raoult, 2003) и Filamoeba sp. .(4,3%, в 26) (Брейман и др., 1990). Rhizaria и Stramenopiles были представлены несколькими членами (особенно в биопленке 35), и известно, что они пасутся на L. pneumophila (Amaro et al., 2015). В целом совместное появление L. pneumophila и его потенциальных хозяев наблюдалось в 11 биопленках (рис. 4C и дополнительная таблица S11), в двух биопленках (15 и 22) с использованием либо секвенирования, либо культивирования/микроскопии, либо обоих методов. методы обнаружения соответственно.Интересно, что образец 22 также показал одно из самых высоких количеств родов ( n = 282) с наиболее равномерным распределением родов (J’ = 0,71), т. е. с наибольшим разнообразием родов H’ (из 4). Он был собран из 42-летней циркуляционной линии (F) 53-летнего здания, где измеренная приблизительная температура воды (по крайней мере, в момент отбора проб) была около <50°C, что свидетельствует о том, что возраст здания, а также система трубопроводов в сочетании с более низкими температурами могут способствовать распространению FLP- Legionella spp.взаимодействия. Однако, как видно на рисунке 4B, большое количество последовательностей осталось неназначенным (т. е. не показало сходства с последовательностями в эталонной базе данных), что указывает на большое количество таксонов в наших выборках, которые не были хорошо представлены в PR2 v4. .11.1 справочная база данных (Guillou et al., 2012). Зависимость от эталонных баз данных является хорошо известным основным ограничением подходов, основанных на выравнивании последовательностей, используемых для определения таксонов в исследованиях секвенирования (Chaudhary et al., 2015; Vilne et al., 2019), особенно с учетом того, что доля Protozoa/Amoeba, которые, скорее всего, еще не культивируются или еще не известны, может быть велика (Guillou et al., 2012).

Питьевая вода в Риге подается как из поверхностных, так и из подземных источников. В рамках Рижского проекта «Вода и окружающая среда» (в 2001 г.) первичное хлорирование было в значительной степени заменено озонированием и биофильтрацией (Юна и Клавинш, 2001; Спринге и Юхна, 2007) перед подачей воды конечным потребителям.Следует отметить, что хлорирование все еще используется в некоторой степени, но концентрация хлора была снижена с 0,5 до 0,2 мг л ^-1 . Тем не менее, с 2016 г. хлорирование высокой концентрации (0,5 мг л ⁻¹ ) применяется в течение трех дней подряд раз в два года для тщательной дезинфекции системы питьевого водоснабжения. К сожалению, у нас нет данных о составе биопленки до изменения стратегии обеззараживания воды от первичного хлорирования с использованием высокой концентрации хлора (0.5 мг ^-1 ) к смешанному подходу, сочетающему низкую концентрацию хлора (0,2 мг ^-1 ) с озонированием и биофильтрацией (за исключением трех дней подряд каждые два года при высококонцентрированном хлорировании (0,5 мг л ^-1 ) применяется для тщательной дезинфекции системы питьевого водоснабжения, внедренной в 2016 г.) (Юхна и Клавинш, 2001; Спринге и Юхна, 2007). Насколько нам известно, в научной литературе не было описано ни одного аналогичного исследования, поэтому мы не можем объяснить наши результаты с точки зрения этого изменения.Тем не менее некоторые сходные аспекты можно найти и в других исследованиях. Например, интеграция озонирования и биофильтрации изучалась во Вьетнаме, где экспериментальные системы в течение двух месяцев эффективно удаляли растворенный органический углерод, снижали потенциал образования тригалометана (вредный побочный продукт дезинфекции) и концентрацию Fe2+ и N -Nh5+, что является важным аспектом, учитывая, что микроорганизмы в системах водоснабжения потребляют растворенные соединения для своего метаболизма (Nguyen et al., 2020). Кроме того, в предыдущем исследовании в Риге, где в течение 1 года осуществлялся мониторинг двух разных участков для отбора проб в распределительной сети, было обнаружено, что после хлорирования рост бактерий в пробах воды ограничивался содержанием фосфора и органического углерода. , а также наличием азота и железа (Nescerecka et al., 2018). Оба метода очистки воды рекомендуются ВОЗ, хотя некоторые патогены, передающиеся через питьевую воду, такие как Legionella, Mycobacteria и Pseudomonas aeruginosa , выживают и растут в биопленках, и их можно защитить от хлорирования (World Health Organization, 2017).Было обнаружено, что 0,2 мг ^-1 свободного хлора не могут вызвать 4-логарифмическое снижение L. pneumophila серогруппы 1 (Cervero-Aragó et al., 2015), в то время как озонирование может привести к значительной логарифмической инактивации этого серогруппа (Domingue et al., 1988). В то же время были исследования, не обнаруживающие Legionella spp. в биопленках хлораминированных систем по сравнению с биопленками безостаточных систем (Waak et al., 2018). Также были проведены некоторые исследования, не подтверждающие влияние озонирования на наличие Legionella (Blanc et al., 2005), и демонстрируют, что высокие температуры воды более эффективны (Cervero-Aragó et al., 2015). В связи с этим Legionella spp. бирюзовый модуль продемонстрировал очень значимую отрицательную корреляцию с температурой воды, что подтверждает рекомендации ВОЗ по минимальной температуре горячей воды (>50°C). Другие меры контроля для сведения к минимуму роста биопленки, рекомендованные ВОЗ, включают оптимизацию удаления органического углерода, ограничение времени пребывания воды в распределительных системах и сохранение остатков дезинфицирующих средств (Всемирная организация здравоохранения, 2017 г.).

Что касается профилирования сообщества систем очистки воды с применением озонирования и биофильтрации, в нашем исследовании мы обнаружили, что на уровне типа бактериальные сообщества содержат так называемый «основной микробиом» водной фазы, который в основном состоит из Альфа — и Beta-proteobacteria , и в меньшей степени Gamma-proteobacteria, Nitrospirae, Planctomycetes, Acidobacteria, Bacteroidetes и Chloroflexi (Zhang and Liu, 2019).Основными семействами среди бета-протеобактерий являются Burkholderiaceae, Methylophilaceae, Comamonadaceae и Rhodocyclaceae , тогда как Sphingomonadaceae, Caulobacteraceae и Methylobacteriaceae являются доминирующими в Alpha-9863 Alpha-9863 протеобактериях. Мы не говорим, что «основные роды и виды» и их связь с дезинфицирующим средством еще не определены (Bautista-de Los Santos et al., 2016), цитируется Zhang and Liu (2019). Фактически была выдвинута гипотеза о том, что «основной геном» фазы биопленки может быть нелегко определить из-за пространственно изменчивых экологических ниш и экологической последовательности (Zhang and Liu, 2019).

В совокупности это первое исследование в Латвии, в котором используется секвенирование нового поколения для изучения биопленочных сообществ труб питьевой воды. Ясно, что необходимо провести дальнейшие дополнительные исследования, в том числе и на левом берегу «Даугавы», который получает очищенную речную воду в качестве основного источника воды. Воздействие исходной воды также заслуживает дальнейшего изучения в сочетании с другими факторами окружающей среды, рассматривая каждый многоквартирный дом с его теплообменниками как замкнутую систему.В заключение, наше исследование подтверждает известную корреляцию между составом биопленок труб горячей воды и несколькими факторами окружающей среды, такими как температура воды и источник, и предоставляет ресурсы для будущих исследований в Латвии, чтобы понять, как окружающая среда формирует биопленки, установленные в них экологические отношения. и как это потенциально связано с качеством воды в домашнем хозяйстве и риском для здоровья населения. Мы надеемся, что наши результаты могут способствовать будущим изменениям в правилах, таких как рекомендуемая минимальная температура горячей воды или рекомендации по замене водопроводных труб и смягчению других факторов риска, связанных с распределительной системой.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные о последовательностях доступны в базе данных Европейского нуклеотидного архива (ENA) под номерами доступа PRJEB27134 (45 образцов, для которых было выполнено секвенирование ампликона 16S рРНК) и PRJEB31264 (12 образцов, для которых было выполнено секвенирование ампликона 18S рРНК).

Вклад авторов

OV и LG-I разработали и руководили исследованием, а также написали рукопись. BV проанализировал данные и написал рукопись.JĶ провела эксперименты, проанализировала данные и написала рукопись. А.М., Г.К. и С.М. проводили эксперименты. DP собрал и обработал образцы данных. Все авторы участвовали в пересмотре и редактировании рукописи, а также прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом No.5 Разработка и применение методик исследования устойчивости микроорганизмов и других биологических и химических рисков в пищевой цепи (РИСК) (грант № 10-4/ВПП-7/5).

Конфликт интересов

BV является генеральным директором SIA net-OMICS, компании, занимающейся анализом биоинформатики.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов.Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Благодарности

Мы также хотели бы поблагодарить АО RĪGAS SILTUMS в Латвии, в частности, Uǧis Osis, Artis Benefelds и Gints Bērze, а также всех технических работников, которые помогли нам в организации и сборе проб труб горячего водоснабжения. распределительные сети многоквартирных домов в Риге во время ремонтных работ в мае и июне 2017 года.Мы также благодарим Валерия Лопатова из BIOR за подготовку образцов труб для последующей обработки.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frwa.2021.799840/full#supplementary-material

Сокращения

BH, Бенджамини-Хохберг; БСА, бычий сывороточный альбумин; ENA, Европейский архив нуклеотидов; FDR, частота ложных открытий; FLP, свободноживущие простейшие; H’ — индекс разнообразия Шеннона; J’ — ровность Пиелоу; К.О., КЭГГ Ортология; л.pneumophila , Legionella pneumophila ; NCBI, Национальный центр биотехнологической информации; OTU, операционная таксономическая единица; PanFP, функциональные профили на основе пангенома; PAS, солевой раствор амебы Пажа; PE, парный конец; PYG, пептонные дрожжи-глюкоза; рРНК, рибосомальная РНК; S — количество различных таксонов в каждом образце; spp., «несколько видов»; WGCNA, анализ взвешенной корреляционной сети.

Сноска

Ссылки

Абисадо, Р. Г., Беномар, С., Клаус, Дж. Р., Дандекар, А.А. и Чендлер, Дж. Р. (2018). Чувство бактериального кворума и взаимодействие микробного сообщества. MBio 9, e02331–e02317. doi: 10.1128/mBio.02331-17